Summary

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Published: July 08, 2011
doi:

Summary

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Abstract

Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems, die eine kritische Rolle bei der Einleitung und Reaktion auf eine Infektion 1 sein. Nachweis von pathogenen Antigen, das durch naive DCs wird durch pattern recognition receptors (PRR), die in der Lage, bestimmte konservierte Strukturen bezeichnet als pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) zu erkennen sind. Erkennung von PAMPs von DCs löst eine intrazelluläre Signalkaskade führt deren Aktivierung und Umwandlung zu reifen DCs. Dieser Prozess wird in der Regel durch die Produktion von Typ-1-Interferon gemeinsam mit anderen proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist, Hochregulation von Zelloberflächenmarker wie MHCII und CD86 und Migration der reifen DC zu drainierenden Lymphknoten, wo die Interaktion mit T-Zellen löst die adaptive Immunantwort 2, 3. So verlinken DCs der angeborenen und adaptiven Immunsystem.

Die Fähigkeit, die zugrunde liegenden molekularen Netzwerke DC Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger sezieren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Regulation dieser Signalwege und ihrer induzierten Gene. Es sollte auch dazu beitragen, die Entwicklung von DC-basierte Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Tumoren. Allerdings hat diese Linie der Forschung ist stark von der Schwierigkeit der Transfektion von primären DCS 4 behindert.

Virus Transduktion Methoden, wie die lentiviralen Systems werden in der Regel verwendet, tragen aber viele Einschränkungen wie Komplexität und bio-Ex-Risiko (mit den damit verbundenen Kosten) 5,6,7,8. Darüber hinaus erhöht die Lieferung von viralen Genprodukte die Immunogenität dieser transduzierten DCs 9,10,11,12. Die Elektroporation wurde mit gemischten Ergebnissen 13,14,15 verwendet worden, aber wir sind die ersten, die Verwendung einer High-Throughput-Transfektionsprotokolls Bericht und schlüssig nachweisen seine Nützlichkeit.

In diesem Bericht fassen wir ein optimiertes Protokoll für die kommerziellen High-Throughput-Transfektion von primären humanen DCs, mit begrenzten Zelltoxizität und das Fehlen von DC Reifung 16. Transfektionseffizienz (von GFP-Plasmid) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mehr als 50% bzw. 70%. FACS-Analyse wurde das Fehlen Erhöhung der Expression der Reifung Marker CD86 und MHCII in transfizierten Zellen, während qRT-PCR zeigte keine Hochregulation von IFNβ. Mit dieser Elektroporation Protokoll, bieten wir Beweise für eine erfolgreiche Transfektion von DCs mit siRNA und effektive knock down von gezielten Gen RIG-I, ein wichtiger viraler recognition receptor 16,17, sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Protocol

1. Programmieren Sie die Amaxa 96 well Shuttle Nucleofector Öffnen Sie eine neue Parameter-Datei. Wählen Sie die Anzahl der Bohrlöcher Sie für Standard-Transfektion verwenden, indem Sie den Cursor über den 96-Well-Platte Diagramm wird. Verwenden Sie ein Minimum von 3 Brunnen zu bündeln für jede experimentelle Probe. Geben Sie den Programm-Code: in part1 wählen 'FF' und in part2 wählen '168 'aus dem Pulldown-Menüs Von Solution Box wählen Sie "Monozy…

Discussion

Effiziente Transfektion von primären naiven dendritischen Zellen ist für hohen Durchsatz-Analyse und Reverse Engineering von zellulären Entzündungswege in diesem wichtigen Zell-Vermittlung der angeborenen-adaptive Immunsystem Übergang wichtig. Allerdings finden die meisten Forscher, dass diese Zellen nur schwer effizient und ohne die Transfektion induzieren Zellreifung transfizieren bei der Verwendung von Standard-Transfektion Techniken sind. Wir untersuchten, ob diese Einschränkungen, die im Hochdurchsatz-Protoko…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das Projekt wurde vom NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C unterstützt. Wir danken Ming Chen für seine technische Unterstützung.

Materials

Equipment/Reagent Company Catalogue # Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Lonza 108S0109 Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit Lonza VHPA-2007 Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA Dharmacon L-012511-00  
GLO siRNA Dharmacon D-001600-01-20  
RPMI 1640 Invitrogen 11875 Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM Invitrogen 11965  
L-glutamine Invitrogen 25030081  
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070063  
Fetal Calf Serum HyClone 3070.03  
Dendritic Cells New York Blood center   DCs are purified from buffy coats using a standard procedure

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation. J. Vis. Exp. (53), e2766, doi:10.3791/2766 (2011).

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