Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas
Summary
Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.
Abstract
Desenvolvimento da doença e progressão são caracterizados por freqüentes aberrações genéticas e epigenéticas, incluindo rearranjos cromossômicos, os ganhos e perdas no número de cópias e metilação do DNA. Avanços em alto rendimento, tecnologias genome-wide perfis, tais como microarrays, têm melhorado significativamente nossa capacidade de identificar e detectar essas alterações específicas. No entanto, como tecnologia continua a melhorar, continua sendo um fator limitante da qualidade da amostra e disponibilidade. Além disso, informações de acompanhamento clínico e prognóstico da doença são muitas vezes coletados anos após a coleta da amostra inicial. Espécimes, normalmente fixado em formalina e incluídos em parafina (FFPE), são armazenados em arquivos hospital por anos a décadas. DNA pode ser eficiente e eficaz recuperado de parafina espécimes se o método adequado para a extração é aplicada. DNA extraído de alta qualidade a partir de amostras devidamente preservados e armazenados pode suportar ensaios quantitativos para comparações de tecidos normais e doentes e geração de assinaturas genéticas e epigenéticas 1. Para extrair o DNA de amostras de parafina, fragmentos de tecido ou tecido microdissecção são submetidos a tratamento xileno, que dissolve a parafina do tecido, e depois reidratados usando uma série de lavagens de etanol. Proteínas e enzimas prejudiciais, tais como nucleases são posteriormente digeridos por proteinase K. A adição de tampão de lise, que contém agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio (SDS), facilita a digestão 2. Ácidos nucléicos são purificados a partir do lisado dos tecidos usando tampão saturada centrifugação velocidade fenol e alta, que gera uma solução bifásica. DNA e RNA permanecem na fase aquosa superior, enquanto que as proteínas, lipídios e polissacarídeos são seqüestrados na inter-orgânicos e fases, respectivamente. Retenção da fase aquosa e repetidas extrações fenol gera uma amostra limpa. Após extrações fenol, RNase A é adicionado para eliminar RNA contaminantes. Extrações adicionais fenol seguintes incubação com RNase A são utilizados para remover qualquer enzima restantes. A adição de acetato de sódio e isopropanol DNA precipita, e centrifugação de alta velocidade é usada para sedimentar o DNA e facilitar a remoção isopropanol. Excesso de sais transitadas de precipitação podem interferir com a subseqüente ensaios enzimáticos, mas pode ser removida do DNA por lavagem com etanol 70%, seguido por centrifugação a re-pellet o DNA 3. DNA é re-suspensas em água destilada ou a reserva de escolha, quantificado e armazenado a -20 ° C. DNA purificado pode posteriormente ser utilizado em aplicações a jusante, que incluem, mas não estão limitados a, PCR, matriz hibridização genômica comparativa 4 (array CGH), imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP) e seqüenciamento, permitindo uma análise integrada de amostras de tecido / tumor.
Protocol
Discussion
Tecidos biopsiados ou extirpado cirurgicamente para análise histopatológica eo diagnóstico muitas vezes são fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) para o armazenamento de longo prazo. Com o crescente interesse na compreensão da base genética da doença, a capacidade de extrair DNA dessas amostras representam uma valiosa fonte de material de diagnóstico que pode ser usado para a análise genômica e estudos translacionais. Amostras historicamente FFPE não foram consideradas uma fonte viável para a análise molecular de ácidos nucléicos podem ser pesadamente modificadas por ácido nucléico e proteína-proteína-proteína reticulação 6. No entanto, a descoberta de que a digestão protease releases fragmentada ácidos nucléicos que são adequados para análises a jusante, incluindo PCR, CGH array, seqüenciamento e perfil de metilação, permite o uso destes espécimes valiosos para a análise genética 6.
Extração de DNA de tecidos incluídos em parafina é um procedimento robusto que depende de solubilidade diferencial para purificar DNA. Qualidade do DNA extraído ea quantidade eo sucesso da amplificação do DNA subseqüente é dependente de um número de parâmetros antes, durante e após a extração. Estes incluem, mas não estão limitados a: tipo e quantidade de tecido, o tipo de fixador utilizado para preservação de tecido, a duração da fixação, a idade do bloco de parafina e as condições de armazenagem, bem como o comprimento do segmento de DNA que se deseja amplificado 1,7. Remoção de parafina do tecido é a etapa mais crítica para a extração de sucesso como a parafina não dissolvido leva a qualidade da amostra pobres e inibição da PCR.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lam para a sua avaliação e críticas deste vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Riferimenti
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
