Desenvolvimento de ensaios personalizado na plataforma ViBE para mais sensíveis, reprodutíveis, os resultados automatizados em matrizes complexas é descrito. O cartucho universal permite ensaios para ser facilmente adaptadas para uso com ensaios personalizado. Esta versatilidade permite o rápido desenvolvimento e validação de ensaios de romance ou versões automatizada de ensaios existentes manual, exemplificado neste vídeo.
Ensaios personalizado para proteínas específicas são muitas vezes limitadas ao tempo de detecção manual de consumir e as técnicas de quantificação, tais como ELISA ou Western blot, devido à complexidade do desenvolvimento em plataformas alternativas. Proprietários BioScale de Membrana acústica micropartículas tecnologia (AMMP) permite imunoensaios sanduíche para ser facilmente desenvolvidos para uso na plataforma ViBE, proporcionando uma melhor sensibilidade, reprodutibilidade e operação automatizada. Fornecido como um exemplo, este protocolo descreve o procedimento para o desenvolvimento de um costume chinês Hamster Proteína de Célula Ovário-Host (CHO-HCP) ensaio. Os princípios gerais aqui delineados podem ser seguidas para o desenvolvimento de uma ampla variedade de imunoensaios.
AMMP um ensaio concentração do antígeno medidas medindo mudanças na freqüência de oscilação causada pela ligação de micropartículas à superfície do sensor de calcular. É composto de quatro componentes principais: (1) um cartucho que contém um chip sensor funcionalizados oito (2) anticorpo marcado micropartículas magnéticas, (3) anticorpo hapteno marcado que se liga à superfície do chip funcionalizados (4) amostras contendo o antígeno de interesse. BioScale biosensor é um dispositivo ressonante que contém oito individuais com membranas separadas caminhos fluídico. As membranas alterar a freqüência de oscilação em resposta a massa acumulando na superfície e essa mudança de freqüência é usada para quantificar a quantidade de massa adicionada.
Para facilitar o uso em uma ampla variedade de imunoensaios o sensor é funcionalizada com um anticorpo anti-hapteno. Anticorpos específicos ensaio são modificados por meio da conjugação covalente de um tag hapteno a um anticorpo e biotina para o outro. O rótulo biotina é usada para vincular o anticorpo para estreptavidina acoplado esferas magnéticas que, em combinação com o anticorpo hapteno-tagged, são usados para capturar o analito em um sanduíche. O complexo se liga ao chip através da interação anti-hapten/hapten. No final de cada ensaio os sensores são limpas com um ácido diluído permitindo a análise seqüencial de colunas de uma placa de 96 poços.
Aqui, apresentamos o método para o desenvolvimento de um costume CHO-HCP ensaio AMMP para o desenvolvimento de bioprocessos. Desenvolvimento de ensaios AMMP ou modificar ensaios existentes em ensaios AMMP pode proporcionar um melhor desempenho (sensibilidade, reprodutibilidade) em amostras complexas e tempo do operador. O protocolo mostra os passos para o desenvolvimento ea seção de discussão opiniões resultados representativos. Para uma explicação mais aprofundada da otimização do ensaio e os parâmetros de personalização contato BioScale. Este kit oferece genéricos ensaios de desenvolvimento de bioprocessos, como proteína residual Um título do produto, e CHO-HCP.
Os exemplos anteriores demonstram altamente sensível AMMP de resultados quantitativos em amostras complexas. Esse desempenho, quando entregues com a facilidade e controle de formatação reagentes para o sistema é propício para uma variedade de aplicações. Os pedidos podem ser específicos para um alvo, como em Gadd34 no tumor, ou genérico para um espectro de alvos, como na série de detecção e quantificação de proteínas de células em amostras que cruzam o fluxo de purificação. A plataforma ViBE baixo overhead combinado com AMMP altamente flexível fornece uma ferramenta poderosa para a entrega de ensaios críticos.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit | ||||
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations | ||||
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab) | ||||
Streptavidin magnetic beads | BioScale | (10 mg/mL) ~108 beads/mg | ||
Magnet for microcentrifuge tubes | New England BioLabs | cat # S1510S | ||
Biotinylated BSA for blocking | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||||
PBS 0.1% Tween 20 | ||||
Vortex | ||||
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator | ||||
Antibody or protein to be labeled | ||||
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit | ||||
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm. | ||||
Diluent | BioScale | to dilute beads and FlAb | ||
Sample Diluent | BioScale | to dilute samples and calibrators | ||
Running Buffer Additive | BioScale |