1. Utrustning och material Dessa experiment använder en standard elektrofysiologi installation består av en stimulator, en stimulans isoleringsanläggningen, två förstärkare mikroelektrod, ett datainsamlingssystem och en dator med samling programvara. Ytterligare utrustning inkluderar en Faradays bur, ett stereomikroskop på en bom stativ, en vibrationsisolering bord, en ljuskälla, och en inspelning plattform. Fem micromanipulators används. Två micromanipulators kräver bra kontroller för positionering inspelningen elektroder, medan de övriga tre micromanipulators endast kräver grov kontroller för att placera två stimulans elektroder och marken elektroden. Den mikromanipulator för DLM inspelning elektroden är placerad vid svansen slutet av beredningen (till vänster om försöksledaren) och mikromanipulator för TTM inspelning elektroden är placerad mellan försöksledaren och den sida av preparatet (något till vänster om försöksledaren). De två micromanipulators som kommer att hålla simuleringen elektroder placeras i spetsen av preparatet (rätt försöksledaren). Den mikromanipulator för jordelektroden är placerad vid bortre sidan av preparatet Dra microelectrodes glas inspelning med motstånd på 40-60 Mohm och lagra plant i en maträtt som stöds av vax. För stimulering, två elektrolytiskt (NaOH) vässade volframelektroder används. En volfram tråd, eller en tredje elektrolytiskt påhittade elektrod används som grund. Den stimulerande och jordelektroder är beredda och knytas till micromanipulators innan den experimentella sessionen och behöver inte bytas ut under hela sessionen. 2. Förbereda D. melanogaster När din utrustning är inställd, är det dags att förbereda sig flugorna. Bedöva flugorna genom att kyla dem is eller med hjälp av CO 2. Om CO 2 används, tillräckligt med tid (ca 20 min) för effekterna av gasen avta innan du påbörjar experimentet. Använd pincett för att överföra flugor försiktigt genom sina ben till en maträtt som innehåller en plattform av mjukt vax lutande i en vinkel på ca 45 °. De följande fyra stegen görs under ett dissekera mikroskop bort från (men nära) i färdskrivaren. Nästa steg är att trygga flyga i vax. Orient flugan ventrala nedåt, med sin främre uppåt på sluttningen. Använda ett par fina tång, förlänga benen utåt, i par, och skjut dem i vax. Bekanta dig med var de muskler som skall spelas från: ryggstycket längsgående muskler, eller DLM och tergotrochanteral muskler, eller TTM. Den subcutan infästning i nätverket DLMS överensstämmer med regionen mellan bröstkorg mittlinjen och den främre rygg borst (eller hårkanten). TTM bifogade platser är belägna dorsalt i bakre och främre överstatlig Alar borst. Att se till att vingarna inte hindrar tillgång till DLM eller TTM fibrer, håller vingarna utåt och "limma" dem med vax. Använda en fin pincett, dra snabel utåt noga och säkra den genom att sänka ned den i vax. Detta är ett kritiskt steg som kräver lite övning eftersom snabel är mjuk och är lätt loss från resten av huvudet. Om det händer, kassera flyga och börja om. Underlåtenhet att säkra huvudet på detta sätt leder till problem när du sätter den stimulerande elektroder genom ögonen. 3. Placering av elektroderna När flugan är förankrad i vax, överföra skålen med den bifogade flyga under stereomikroskop som är placerad inuti Faradays bur. Orientera flyger i sidled med huvudet för att flyga till höger om försöksledaren. Nästa steg är att sätta elektroderna. Jord och stimulerande elektroder kan föras in utan att titta i mikroskopet. Bra inspelningar är beroende av precisa impalement, så det är en bra idé att öva hantering av micromanipulators. Ta elektroderna nära platser för insättning med hjälp av micromanipulators att underlätta korrekt placering och efterföljande inspelningar. Sänk jordelektroden i den bakre änden av buken med hjälp av justeringen hjulen på mikromanipulator. För att placera vässade volfram stimulerande elektroder i hjärnan, använd mikromanipulator att placera spetsen på en av elektroderna så att det bara rör en av flugans ögon. Gör likadant med den andra så att båda elektroderna är precis når utanför varje öga. Tryck sedan in elektroder i sin tur, genom varje öga så de tips av elektroderna nå hjärnan som ligger på baksidan av huvudet kapsel (ca 2-3mm). Rätt placerade elektroder kommer att aktivera Giant Fiber System. För att testa att stimulerande elektroder placeras på rätt sätt, använda en kort (0,03 ms) stimulans av 30-60V över stimulerande elektroder, och leta efter rörelsen av vingar och ryckningar av flygningen / benet muskler " Nästa steg är att back-fylla glaset microelectrodes med 3M KCl hjälp av en Hamilton eller värme-drog plastspruta, och placera dem i fina kontroll micromanipulators. Ordentligt microelectrodes kan användas för flera rundor av experiment. Den första inspelningen elektroden kommer att införas i en DLM fiber. Det finns två bilateralt symmetrisk DLMS, var och en består av sex enskilda muskelfibrer. Inspelningarna kan göras från någon av de sex fibrer, men de vanligaste är DLM fibrer 45a och 45b på deras goda tillgänglighet genom den dorsala sidan av bröstkorg nagelband, och det faktum att båda fibrer är innerveras av samma motorneuron . Använda mikromanipulator på sidan längst bort från dig, sätter en inspelning elektroden i DLM fibrer 45a eller b. Lutningen på plattformen gör det möjligt för DLM elektroden att gå in i ryggens nagelband på en ~ 60-90 ° vinkel, vilket underlättar penetration. Använda programvaran i oscilloskopet läge och titta på datorskärmen när du sätter in elektroder i bröstkorgen. När elektroden har gått in i en muskel baslinjen kommer att sjunka till nära noll eller ett negativt värde. Testa med en stimulans för att se om du kan observera muskeln svar. Sätt i den andra inspelningen elektrod i TTM närmast dig. Denna elektrod sätts sidled framför dig, på grund av placeringen av muskeln applikationsstället. Återigen observera monitorn medan du gör detta och testa med en enda stimulans när spår visar elektroden i muskeln. 4. Stimulans och inspelning Du är nu redo att börja stimulera hjärnan och svar inspelning från benet och musklerna flygning. Applicera en kort (0,03 ms) stimulans över stimulerande elektroder börjar vid 30 V och ökar till 60 V tills du observerar en respons (dvs. en muskelryckningar, och en muskelcell depolarisation som observerats på datorskärmen). För resten av försöket, som den spänning 5-10 V ovan svaret tröskeln. För att mäta respons latens, ge minst 5 enstaka stimuli med 5 sekunders vila mellan varje stimulus. Bestäm "frekvensen av följande" genom att tågen av stimuli i olika takt. Typiskt 10 tåg av 10 stimuli ges i 100 Hz (10ms mellan varje stimulus), 200Hz (5ms mellan varje stimulus) och 300Hz (3 ms mellan varje stimulus). Låt en viloperiod på 2 sekunder mellan varje tåg av stimuli. 5. Resultat: Response latency och frekvens Efter i Giant Fiber Pathway Svaret fördröjning är tiden mellan stimulering av hjärnan och depolarisation av muskeln. Denna siffra kan jämföras svaret latenser för DLM och TTM till en enda stimulans. Latenser mellan 0,7 och 1,2 ms för GF-TTM vägen och mellan 1,3 och 1,7 ms för GF-DLM väg tyder på en hälsosam förberedelserna och inspelningsteknik. Den latenser kan variera med genotyp, genetisk bakgrund, temperatur och ålder. Figur 1 (A och B). Representant spår som visar svaren in från TTMs och DLMS efter en stimulans som tillämpas på hjärnan. Som visas här, inspelningar från TTM visa större variation i termer av amplitud och form postsynaptiska potentialen (PSP) jämfört med dem från de stora DLM fibrer, denna ökade variation beror på att den lilla storleken på TTM muskelfibrerna. Denna variation är dock inte påverkar de värden respons latens för Giant Fiber-to-TTM väg. Figur 1 (C och D). Ytterligare svar latency "spår från 4 individuella flugor för både TTM och DLM. Observera TTM spår uppvisar variationer i PSP-form men svaret latens är opåverkad. För DLM det finns mindre variationer i PSP form. Jämför "frekvensen av följande" vid 100 Hz, 200 Hz och 300 Hz genom att beräkna andelen lyckade svar (av 10) för både DLM och TTM vägar vid varje stimulering frekvens. Vid 100 Hz, både TTM och DLM följ stimuli 01:01. Vid stimulering frekvenser över 100 Hz, DLM svaren börjar visa fel, eftersom den förmedlande kemiska synapsen mellan två interneuronen inte har tillräckligt med tid att återhämta sig mellan stimuli. TTM svar, dock fortfarande 1:1 med stimuli även utanför 300Hz. Figur 2. Representant spår som visar "frekvensen av följande" inspelningar. Vid 100 Hz, både TTMs och DLMS svara på alla 10 stimuli (till vänster). Vid 200 Hz, den DLM svaren börjar misslyckas (asterisk). 6. Representativa resultat Vildtyp kort latens svar (stimulerad elektroder placeras i ögonen, förbi sensoriska receptorer och utlöser GF kretsen direkt) beror på genotyp, genetisk bakgrund, temperatur och ålder, och ligga mellan 0,7 och 1,2 ms för GF-TTM vägen och 1,3 and1.7 ms för GF-DLM vägen (Tanouye och Wyman, 1980, Thomas och Wyman, 1984; Engel och Wu, 1992; Allen och Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, opublicerad). . Denna mycket korta TTM fördröjning beror på att den robusta GF-TTMn elektrokemiska synaps av monosynaptic vägen och längre DLM latens uppstår på grund av disynaptic typ av väg samt närvaron av en kemisk synaps (PSI-DLMn). Intermediate och lång latenstid svar (> 3 ms) resultatet av aktivering av GF afferenter och uppnås antingen genom att använda en lägre intensitet stimulering eller ge en visuell ("light-off") signal. Vid 100 Hz både TTM och DLM bör följa stimuli 01:01. Över 100Hz DLM svar kommer börja visa fel som den kemiska synapsen mellan PSI och DLMns inte har tillräckligt med tid att återhämta sig mellan stimuli mindre än 10ms isär. TTM svaren dock kommer att förbli 1:1 med stimuli även utanför 300Hz (Tanouye och Wyman, 1980, Engel och Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Mutationer i shakB genen kodar en Drosophila gap junction-kanal ("innexin"), kraftigt öka responsen latens av GF-TTM vägen (~ 1,5 ms) medan GF-DLM gren svarar inte (Allen och Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). Den muterade svar kan återställas genom att stimulera bröstkorg ganglier direkt, vilket visar att den fördröjda effekten inte beror på störd neuromuskulär transmission. Förmågan att följa högfrekvent stimulering är också nedsatt hos dessa mutanter jämfört med vildtyp flugor där GF-DLM och GF-TTM vägar brukar kunna följa 10 stimuli med förhållandet 1:1 upp till 100 Hz och 300 Hz, respektive. Det är viktigt att notera att dessa frekvenser är betydligt över det normala stimulans frekvenser tas emot av den upphandlande musklerna under den långvariga flygningar (3-10 Hz) (Hummon och Costello, 1989). En annan parameter som används för att beskriva stabiliteten i GFS utgångarna är "refraktär period", eller den minimala tiden mellan två stimulans pulser som fortfarande producerar två svar från muskeln. Den eldfasta varierar mellan 1-4 ms för TTMs och 7-15 ms för DLMS. Den jämförelsevis långa refraktärperioden för DLMS beror på att relativt labil kemiska synapser i PSI-DLMn korsningen (Tanouye och Wyman, 1980; Gorczyca och Hall, 1984; Engel och Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen och Godenschwege, 2010).