विशालकाय फाइबर के मार्ग से electrophysiological रिकॉर्डिंग डी. मेलानोगास्टर</em
Summary
विशालकाय फाइबर सिस्टम वयस्क के एक साधारण neuronal सर्किट<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> मक्खी में सबसे बड़ा न्यूरॉन्स युक्त. हम इस मार्ग के माध्यम से पृष्ठीय (DLM) अनुदैर्ध्य और tergotrochanteral मांसपेशियों (टीटीएम) में पोस्ट synaptic क्षमता विशालकाय फाइबर interneurons के प्रत्यक्ष उत्तेजना के बाद रिकॉर्डिंग द्वारा synaptic प्रसारण की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the “escape” (or “startle”) response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles – they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g.”air-puff” or “lights-off”) stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring “latency response” (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the “following to high frequency stimulation” (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.
Protocol
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण बातें करने के लिए ध्यान देना जब उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की कोशिश कर रहा है एक उचित स्वास्थ्य और तैयारी के उन्मुखीकरण है. आदर्श रूप में, मक्खी रिकॉर्डिंग सत्र के अंत में अभी भी जिंदा होना चाहिए और बिजली stimuli करने के लिए उत्तरदायी है. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सबसे अधिक कुशलता से वक्ष exoskeleton घुसना करने के लिए, मक्खी इस तरह सतह पर चिपके होना चाहिए के रूप में इलेक्ट्रोड के साथ एक सही कोण के रूप में करने के लिए, यदि आवश्यक हो, इलेक्ट्रोड के सम्मिलन के एक हिस्से को हटाने के द्वारा मदद की जा सकती पृष्ठीय वक्ष छल्ली एक स्केलपेल टंगस्टन के साथ इस प्रकार DLM उड़ान मांसपेशियों (इस कदम कांच इलेक्ट्रोड के सुझावों को तोड़ने के लिए यह कठिन बनाने का एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है) को उजागर. इसके अलावा, ध्यान subcuticularly स्थित DLMs और TTMs के माध्यम से इलेक्ट्रोड धक्का से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. मक्खी के सिर में अच्छी तरह से हो उत्तेजक ठीक से मस्तिष्क में डाला जा इलेक्ट्रोड के लिए अनुमति देने के लिए और रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान बाहर निकाला जा रहा से उन्हें रोकने के सुरक्षित चाहिए.
कारण इसका आकार और अच्छी तरह से वर्णित आकारिकी, GFS ड्रोसोफिला में सबसे सुलभ neuronal रास्ते के एक प्रतिनिधित्व करता है . छोटे आणविक भार ट्रेसर रंजक विद्युत synapses के पारगम्यता विद्युत मिलकर न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है, और कई उपलब्ध GAL4 लाइनों कोशिकाओं या सेल (समूहों याकूब एट अल, 2000 के एक सबसेट में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में हेरफेर करने के लिए संभव बनाते हैं, एलन एट अल, 2006 उपर्युक्त लाभ, habituation, सहज वसूली और dishabituation जैसे सर्किट प्रदर्शन संपत्तियों की दोनों अभिवाही और वक्ष घटकों, ड्रोसोफिला neuronal plasticity के अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रणाली (Engel और वू GFS बनाने के अलावा) , 1996).
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक वेलकम ट्रस्ट अनुदान के द्वारा एल.पी. समर्थित किया गया
Materials
| NAME | COMPANY | CAT. # | COMMENTS |
| S48 Square Pulse Stimulator | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| Stimulation unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
| 5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier | Getting Instruments | http://www.gettinginstruments.com/ | |
| Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
| Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
| Recording platform with manual micromanipulators | Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. | http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ |
|
| Light source | Fostec | http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm | |
| Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | http://www.wild-heerbrugg.com/ | |
| Vibration isolation table | TMC | http://www.techmfg.com/ | |
| Borosilicate tubing for microelectrodes | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
| P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
| Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments | MF34G-5 | http://www.wpi-europe.com/en/ |
| Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Dissecting (stereo) microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/ | |
| Faraday cage | Unknown manufacturer |
Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor…
Riferimenti
- Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. , (2010).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).
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