1. ציוד וחומרים ניסויים אלה להשתמש הגדרת תקן electrophysiology מורכבת ממריץ, יחידת בידוד גירוי, שני מגברים microelectrode, מערכת רכישת נתונים ומחשב עם תוכנת האוסף. ציוד נוסף כולל כלוב פאראדיי, stereomicroscope על סטנד בום, שולחן בידוד רעידות, מקור האור, פלטפורמה ההקלטה. חמש micromanipulators משמשים. שני micromanipulators דורשים שולט בסדר עבור מיקום האלקטרודות הקלטה, ואילו שלושת האחרים micromanipulators רק דורשים שולטת ברוטו לתפקיד שתי אלקטרודות הגירוי האלקטרודה לקרקע. Micromanipulator עבור האלקטרודה הקלטה DLM ממוקם בקצה הזנב של התכשיר (שמאל של הנסיין) לבין micromanipulator עבור האלקטרודה הקלטה TTM ממוקם בין הנסיין לבין הצד של התכשיר (מעט שמאלה של הנסיין). שני micromanipulators כי תקיים את האלקטרודות סימולציה ממוקמים בראש ההכנה (מימין של הנסיין). Micromanipulator עבור אלקטרודה הקרקע ממוקמת בקצה המרוחק של התכשיר משוך הקלטה microelectrodes זכוכית עם התנגדויות של 40-60 MΩ ולאחסן שטוח בצלחת נתמך על ידי שעווה. עבור גירוי, שתי אלקטרודות טונגסטן אלקטרוליטים (NaOH) חידד משמשים. תיל טונגסטן, או אלקטרודה מפוברק אלקטרוליטים השלישית היא לשמש קרקע. האלקטרודות מגרה הקרקע מוכנים ומצורפת micromanipulators לפני תחילת הפגישה ניסיוניים לא צריך להיות מוחלף למשך הפגישה. 2. הכנת ד melanogaster לאחר הציוד שלך מוגדר, זה הזמן להכין את הזבובים. הרדימי הזבובים על ידי קירור עליהם קרח או באמצעות ה-CO 2. אם ה-CO 2 משמש, ולאחר מכן לאפשר זמן מספיק (כ 20mins) את ההשפעות של הגז להתפוגג לפני תחילת הניסוי. שימוש במלקחיים להעביר את הזבובים בעדינות על רגליהם לצלחת המכילה מצע של שעווה רכה משופע בזווית של ° 45 בקירוב. לצד ארבעת הצעדים נעשים תחת מיקרוסקופ לנתח מן הציוד (אבל קרוב) ההקלטה. השלב הבא הוא להבטיח את לטוס שעווה. המזרח בצד הגחון לטוס למטה, עם למעלה הקדמי שלה מול במדרון. בעזרת זוג מלקחיים בסדר, להאריך את הרגליים כלפי חוץ, בזוגות, ולדחוף אותם לתוך השעווה. היכרות עם מיקום השרירים שיירשמו מ: אורך השריר הגבי, או DLM, ואת שריר tergotrochanteral, או TTM. האתרים מצורף subcuticular של DLMs להתכתב עם האזור בין קו האמצע החזי ואת הגב הקדמי זיפים (או setae). האתרים מצורף TTM ממוקמים dorsally של האחורי ואת הקדמי העל עלאר זיפים. וודא כי הכנפיים לא לחסום את הגישה סיבי DLM או TTM, החזק את הכנפיים החוצה "דבק" אותם בשעווה. באמצעות זוג נאה של מלקחיים, למשוך את חוטם החוצה בזהירות, לאבטח אותו על ידי שיקוע אותו לתוך השעווה. זהו צעד קריטי, כי דורש קצת תרגול מאז חוטם הוא רך בקלות מנותק משאר הראש. אם זה יקרה, לבטל את לטוס ולהתחיל מחדש. אי לאבטח את הראש בדרך זו מוביל לבעיות כאשר החדרת אלקטרודות גירוי דרך העיניים. 3. הצמדת אלקטרודות לאחר לטוס מעוגנת השעווה, להעביר את המנה עם לטוס המצורף מתחת stereomicroscope כי הוא נמצא בתוך כלוב פאראדיי. המזרח לטוס הצידה עם הראש של הזבוב בצד ימין של הנסיין. השלב הבא הוא להכניס את האלקטרודות. אלקטרודות קרקע ועידוד יכול להיות מוכנס בלי להסתכל מבעד למיקרוסקופ. הקלטות טוב להסתמך על impalement מדויק, כך שזה רעיון טוב להתאמן הטיפול micromanipulators. תביאו את האלקטרודות קרוב האתרים של הכניסה בעזרת micromanipulators כדי להקל על ביצוע נאות שלהם בהקלטות הבאות. מנמיכים את האלקטרודה לתוך הקרקע סוף האחורי של הבטן באמצעות גלגלי התאמה על micromanipulator. כדי למקם את האלקטרודות טונגסטן חידד גירוי במוח, השתמש micromanipulator עמדת קצה אחד של האלקטרודות כך זה פשוט נוגע באחד עיניו של זבוב. לעשות את אותו הדבר עם השני, כך האלקטרודות הן רק נגיעה החיצוני של כל עין. ואז לדחוף את האלקטרודות, בתורו, דרך עין כל כך קצות האלקטרודות להגיע למוח ממוקם בחלק האחורי של הקפסולה הראש (כ 2-3mm). אלקטרודות המונחות בצורה נכונה יפעיל את מערכת סיבים ענק. כדי לבדוק זאת מגרה את האלקטרודות ממוקמות כראוי, חל גירוי קצר (0.03 ms) של 30-60V על פני אלקטרודות גירוי, ולחפש תנועת הכנפיים של עוויתות שרירים טיסה / הרגל " השלב הבא הוא אל גב למלא את microelectrodes זכוכית עם 3M KCl באמצעות המילטון או חום שלף מזרק פלסטיק, ולהכניס אותם לתוך הקנס שליטה micromanipulators. Microelectrodes הוכנס כראוי יכול לשמש מספר סבבי ניסויים. אלקטרודה ההקלטה הראשון יהיה מוכנס לתוך סיב DLM. ישנם שני DLMs סימטרי בילטרלי, כל אחד מורכב משישה סיבי שריר בודדים. ההקלטות ניתן לעשות זאת מכל שישה סיבים, אולם הנפוץ ביותר הם סיבי DLM 45 א ו – 45B בשל נגישות טובה שלהם דרך הצד הגבי של לציפורן החזה, ואת העובדה כי הן סיבים מעוצבבים על ידי motorneuron אותו . שימוש micromanipulator בצד הרחוק ממך, להוסיף אלקטרודה הקלטה לתוך סיב DLM 45 א או ב השיפוע של הפלטפורמה מאפשרת אלקטרודה DLM להיכנס לציפורן הגב על זווית ~ ° 60-90, אשר מסייע לחדירה. השתמש בתוכנה במצב אוסצילוסקופ ומסתכל על צג המחשב תוך כדי החדרת אלקטרודות הקלטה לתוך בית החזה. כאשר האלקטרודה חתמה שריר הבסיס יירד כמעט לאפס או ערך שלילי. מבחן עם גירוי בודד כדי לראות אם ניתן לראות את תגובת השרירים. הכנס את האלקטרודה הקלטה אחרים לתוך TTM הקרוב ביותר אליך. אלקטרודה זו מוכנס רוחבית, מולך, עקב המיקום של האתר מצורף השריר. שוב להתבונן בצג תוך כדי לעשות את זה ולבדוק עם גירוי בודד פעם עקבות מצביע האלקטרודה היא בשריר. 4. גירוי ו הקלטה כעת אתה מוכן להתחיל מגרה את המוח ואת התגובות הקלטה מהרגל והשרירים הטיסה. החל גירוי קצר (0.03 ms) על פני אלקטרודות גירוי החל V 30 ו גוברת V 60 עד שאתה רואה תגובה (כלומר עווית שרירים, וכן שלילת קוטביות תא שריר כפי שנצפה על צג המחשב). במשך שארית של הניסוי, להגדיר את V 5-10 מתח מעל סף התגובה. כדי למדוד חביון התגובה, לתת לפחות 5 גירויים יחיד עם תקופת מנוחה 5 השני בין כל גירוי. קבע את "תדירות הבאים" על ידי אספקת הרכבות של גירויים בקצב שונה. בדרך כלל 10 רכבות של 10 גירויים ניתנים ב 100Hz (10ms בין כל גירוי), 200Hz (5ms בין כל גירוי) ו 300Hz (3ms בין כל גירוי). אפשר תקופת מנוחה של 2 שניות בין כל רכבת של גירויים. 5. תוצאות: latencies תגובה ותדירות בעקבות במסלול סיבים ענק חביון התגובה הוא הזמן בין גירוי של המוח שלילת קוטביות של השריר. נתון זה משווה את latencies התגובה DLM ו – TTM לגירוי אחד. Latencies בין 0.7 ו 1.2 ms עבור מסלול GF-TTM ובין 1.3 ו 1.7 ms עבור מסלול GF-DLM מצביעים הכנה בריאה טכניקת ההקלטה תקין. Latencies יכול להשתנות עם טמפרטורה, גנוטיפ, הרקע הגנטי לבין גיל. איור 1 (A ו-B). הנציג עקבות מראה תגובות מוקלטות מן TTMs ו DLMs בעקבות גירוי יחיד ליישם במוח. כפי שמוצג כאן, הקלטות TTM את ההצגה השתנות יותר במונחים של משרעת וצורה הפוטנציאל postsynaptic (PSP) בהשוואה לאלה של סיבים DLM גדול; זה השתנות מוגברת בשל גודלו הקטן של סיבי השריר TTM. השתנות זו, לעומת זאת, אינו משפיע על השהיית התגובה ערכי מסלול Fiber-to-TTM ענק. "חביון התגובה" איור 1 (C ו-D). עקבות נוסף מתוך 4 זבובים הפרט הן עבור TTM ו DLM. הערה עקבות TTM התערוכה השתנות בצורת PSP אבל חביון התגובה אינה מושפעת. עבור DLM יש השתנות פחות בכושר PSP. השווה את "תדירות הבאים" ב 100 הרץ, 200 הרץ, ו 300 הרץ על ידי חישוב שיעור התגובות מוצלח (מתוך 10) עבור DLM והן המסלולים TTM בתדר כל גירוי. ב 100 הרץ, הן TTM ו DLM לעקוב אחר גירויים 01:01. בתדרים גירוי מעל 100 הרץ, התגובות DLM להתחיל להראות כשלים כי מתווך סינפסה כימית בין שני interneurons אין מספיק זמן להתאושש בין גירויים. התגובות TTM, לעומת זאת, נשארים עם גירויים 01:01 ואף מעבר 300Hz. איור 2. עקבות נציג מראה את "תדירות הבאים" הקלטות. ב 100Hz, הן TTMs ו DLMs להגיב לכל הגירויים 10 (משמאל). ב 200Hz, התגובות DLM להתחיל להיכשל (כוכבית). 6. נציג תוצאות Wild סוג קצרי חביון תגובות (אלקטרודות לגירוי ממוקמים העיניים, תוך עקיפת קולטנים חושי מפעילה את המעגל GF ישירות) תלוי גנוטיפ, רקע גנטי, טמפרטורה גיל, נעים בין 0.7 ו 1.2 ms עבור מסלול GF-TTM ו 1.3 and1.7 ms עבור מסלול GF-DLM (Tanouye ו ויימן, 1980, תומאס ויימן, 1984; אנגל וו, 1992; אלן Murphey, 2007; פלן et al, 2008;. אוגוסטין ואח', טרם פורסם). . זה חביון TTM קצר מאוד בשל החזקה GF-TTMn אלקטרוכימיים סינפסה של מסלול monosynaptic ואת חביון DLM מתרחשת עוד בגלל האופי disynaptic של מסלול, כמו גם את נוכחותו של סינפסה כימית (PSI-DLMn). בינוני וארוך חביון תגובות (> 3 ms) כתוצאה ההפעלה של afferents GF ו מושגות גם באמצעות גירוי בעוצמה נמוכה יותר או מתן אות חזותי ("אור-off"). ב 100Hz הן TTM ו DLM צריך לעקוב אחר גירויים 01:01. מעל 100Hz התגובות DLM יתחיל להראות כשלים כמו סינפסה כימית בין PSI ו DLMns אין מספיק זמן להתאושש בין גירויים פחות מ 10ms מזה. התגובות TTM, לעומת זאת, יישאר 01:01 עם גירויים ואף מעבר 300Hz (Tanouye ו ויימן, 1980; אנגל וו, 1992;. Allen et al, 2007;. מרטינז et al, 2007). מוטציות בגן shakB, קידוד פער תסיסנית צומת ערוץ ("innexin"), להגדיל באופן משמעותי את חביון התגובה של מסלול GF-TTM (~ 1.5 ms) ואילו הסניף GF-DLM אינו מגיב (אלן Murphey, 2007; פלן et al. 2008). תגובת מוטציה ניתן לשחזר על ידי גירוי ישיר הגנגליונים החזה, הוכחת כי ההשפעה אינה מתעכבת בשל שידור neuromuscular שיבשו. היכולת לעקוב אחר גירויים בתדירות גבוהה נפגעת גם מוטציות אלה לעומת סוג בר זבובים שבו GF-DLM ו GF-TTM המסלולים הם בדרך כלל מסוגלים לעקוב אחר גירויים 10 עם יחס 1:01 עד Hz 100 ו – 300 הרץ, בהתאמה. חשוב לציין כי תדרים אלה הם הרבה מעל תדרים גירוי נורמלי שהתקבלו על ידי כיווץ השרירים במהלך הטיסה מתמשכת (30-10 הרץ) (Hummon וקוסטלו, 1989). פרמטר נוסף המשמש לתיאור את היציבות של תפוקות GFS היא "תקופת עקשן", או זמן מינימלי בין הפולסים גירוי התאום כי עדיין מייצרת שתי תגובות של השריר. בפעם עקשן נע בין 1-4 אלפיות עבור TTMs ו 7-15 מילישניות עבור DLMs. תקופת עקשן ארוך יחסית עבור DLMs נובע יחסית יציב סינפסות כימיות בצומת PSI-DLMn (Tanouye ו ויימן, 1980; Gorczyca היכל, 1984; אנגל וו, 1992; בנרג'י et al, 2004;. אלן Godenschwege, 2010).