Summary

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

Published: December 26, 2010
doi:

Summary

Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected בשני<em> אנופלס gambiae</em> ו<em> אנופלס stephensi</em> תאים.

Abstract

טפילים Plasmodium, הסוכן סיבתי של מלריה, המועברות דרך עקיצות של יתושים נגועים אנופלס וכתוצאה מכך יותר מ -250 מיליון זיהומים חדשים בכל שנה. למרות עשורים של מחקר, אין עדיין חיסון נגד מלריה, המדגישה את הצורך של אסטרטגיות שליטה רומן. גישה אחת היא השימוש החדשני של יתושים מהונדסים גנטית כדי לשלוט ביעילות טפיל המלריה הילוכים. שינויים מכוונת של המסלולים התא איתות היתוש, דרך mutagenesis ממוקד, נמצאו להסדיר טפיל הפיתוח 1. מתוך מחקרים אלה, אנו יכולים להתחיל לזהות מטרות הגן פוטנציאל לשינוי. Mutagenesis ממוקד הסתמכה באופן מסורתי על רקומבינציה הומולוגיים בין גן המטרה מולקולת דנ"א גדולים. עם זאת, הבנייה והשימוש כגון מולקולות דנ"א מורכבות עבור הדור של שורות תאים הפך ביציבות הוא זמן יקר, רב יעיל לעתים קרובות. לכן, האסטרטגיה באמצעות נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA לפיירפוקס) מספק אלטרנטיבה יעילה מציגה תחליפים מלאכותיים נוקלאוטיד בודד לתוך episomal ו כרומוזומליות הגן מטרות DNA (הנסקרת ב 2). LNA-ON בתיווך mutagenesis ממוקד נעשה שימוש כדי להציג את נקודת מוטציות בגנים עניין של תאים בתרבית שמרים והן בעכברים 3,4. אנחנו מראים כאן LNA-RSS יכול לשמש כדי להציג שינוי של נוקלאוטיד יחיד מטרה episomal transfected כי התוצאות מתג מכחול ביטוי חלבון פלואורסצנטי (BFP) לירוק ביטוי פלורסנט חלבון (GFP) הן gambiae אנופלס ו אנופלס תאים stephensi . המרה זו ממחישה בפעם הראשונה כי mutagenesis יעיל של גני מטרה בתאים יתוש יכולה להיות מתווכת על ידי LNA תוספות ומציע כי טכניקה זו עשויה להיות ישימה mutagenesis מטרות כרומוזומליות במבחנה in vivo.

Protocol

לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב כדי לקבוע כי התאים יתוש השתמשו בניסוי בריאים בנקודת המפגש ~ 80% אם חסיד (איור 1). התאים מגודלים או לא בריא תגרום יעילות transfection נמוך ייתן תוצאות לא עקביות. חימום בכל אמצעי התקשורת לפני שימוש באמבט מים C ° 28 …

Discussion

כאן אנו מציגים שיטה במבחנה ראיות המרה ממוקד של נוקלאוטיד יחיד יעד הגן episomal הבאים transfection של LNA לפיירפוקס לתוך A. stephensi וא gambiae תאים. LNA-ON בתיווך המרה הגן דורש גיוס של אתר ספציפי בתגובה DNA תיקון: הנתונים שלנו מצביעים על כך התאים יתוש יכול לתמוך זה מנגנון mutagenesis אתר …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות אבי ספינר במרכז הלאומי לחקר פרימטים קליפורניה לסיוע שלה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי מימון מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI073745, AI080799 ו AI078183.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

Riferimenti

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

Play Video

Citazione di questo articolo
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

View Video