Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.
Endotel hücreleri, damar biyoloji birçok alanda yararlı bir araştırma modeli sağlar. Ilk izolasyon 1 yılından bu yana, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) en çok araştırılan endotel hücreleri, böylece kolay elde etmek ve kültürüne uygun görüldüğü gibi, ve. Ancak, anjiyogenez, geçirgenlik ya da diğerleri gibi süreçler üzerinde odaklanan araştırma, mikrovasküler endotel hücreleri (EC) 2. çalışma çok daha önemli fizyolojik model . Ayrıca, nakavt fareler izole edilen EC protein fonksiyon ex vivo analizi için yararlı bir araç sağlar . Çeşitli yaklaşımlar izole etmek ve kültür mikrovasküler farklı kökenli EC tarihten 3-7 bildirilen, ancak saf EC tutarlı izolasyonu ve kültürü hala birçok laboratuvarda büyük bir teknik sorun var. Burada, biz bir adım-adım protokol yalıtma ve kültür fare akciğer endotel hücreleri (MLECs) güvenilir ve nispeten basit bir yöntem sağlar. Bu yaklaşımda, akciğer dokusu 6 elde edilen 8 gün eski yavrular ilk kollajenaz / dispase (C / D) çözümü ile sindirilmiş, parçalar halinde kesilir ve tek hücre süspansiyonu içine mekanik dağınık. MLECS Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı (PPK) kullanarak Dynabeads konjuge anti-PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanarak hücre süspansiyonu arınmış. Konfluent olana kadar saflaştırılmış Böyle hücreleri (TC) yemekleri, jelatin kaplı doku kültürü kültüre. Bu noktada, hücrelerin daha fazla anti-ICAM-2 antikoru ile birleştiğinde Dynabeads kullanarak saflaştırılmış. Bu protokol ile elde MLECs bir arnavut kaldırımlı fenotip, sergi, faz-kontrast ışık mikroskobu olarak görünür ve kendi endotel fenotipi anti-VE-kaderin 8 ve anti-VEGFR2 9 antikorlar ve immunofluorescent VE kaderin boyama FACS analizi kullanılarak teyit edilmiştir. Bizim ellerde, bu iki adımlı bir izolasyon prosedürü, tutarlı ve güvenilir MLECs saf bir nüfus, daha kültürlü olabilir verir. Bu yöntem, araştırmacılar, eleme ve izole MLECs üzerinde gerçekleştirilen in vitro deneylerde sonuçları in vivo çalışmalar doğrudan ilişkilendirmek için transgenik fareler sayıları giderek artan yararlanmak ve bu nedenle in vivo gözlenen vasküler fenotipleri moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardım sağlayacaktır.
Mikrovasküler EC vasküler biyoloji birçok alanda yararlı bir model olduğu kanıtlanmış ve yaygın olarak incelenmiştir HUVECs 3 'ünden (örneğin anjiyogenez) incelemek için daha fazla fizyolojik ilgili olduğu düşünülmektedir . Daha önce, bu mikrovasküler EC böbrek, kalp, deri, retina, beyin, gliomlar, yağ dokusu ve aynı zamanda akciğer 2, 4-7, 10, 11 elde edilebilir olduğu bildirilmiştir. Ancak, tutarlı ve güvenilir bir yöntemdir mikrovasküler EC izolasyonu için hala gereklidir. Burada sunulan yöntemle, daha önce yayınlanmış bir protokol 2 bir değişiklik; yavrular yerine yetişkin hayvanların kullandığı en yayınlanan prosedürleri farklıdır. Genç hayvanlardan elde edilen hücrelerin çoğalması potansiyeli yüksek ve dokulardan elde edilen kültürler, hücrelerin daha fazla sayıda verim eğilimi olarak bu izolasyon başarısı için çok önemlidir. Bir hafta eski hayvanların en iyi gibi görünüyor, ancak genç farelerde (4 gün eski) de kullanılabilir. Ayrıca, yavruların daha yüksek veya daha düşük sayıda bir yavru MLECs izole başarılı olduğu gibi, gerektiğinde kullanılan olabilir. Ancak, izolasyon işlemini ölçekleme veya aşağı iken, hücre kaplama yoğunluğu bu da hücre çoğalması için kritik olarak değişmeden kalmalıdır. Ilk anti-PECAM-1 konjuge manyetik boncuklar kullanarak MLECs ve anti-ICAM-2 antikorları daha 2 adım arınma süreci çok daha verimli, daha önce açıklanan tek bir adım arıtma işlemleri daha saf EC kültürler elde. Bu protokol, çok zahmetli bir el teknikleri, degrade santrifüj ve fibroblastlar, kan hücreleri ve düz kas hücreleri gibi atarak kirlenmesine neden olan hücreler için sıralama daha az verimli FACS kullanma ihtiyacı ortadan kaldırır. Anjiyogenik yanıtları, damar geçirgenliği ve lökosit göçüne in vitro analizi, iyileşme yanı sıra sinyal yolları biyokimyasal analiz yara sonucu MLEC nüfus kullanılabilir. Gerekirse, MLECs trans-endotelyal direnci (TER) ölçümleri için immünofloresan veya elektrod fibronektin veya jelatin kaplı lamelleri gibi farklı yüzeylerde kaplama olabilir. Elde edilen sonuçlar, giderek artan sayıda nakavt ve transgenik fare hatları bağlamında özellikle önemlidir in vivo gözlenen fenotipleri doğrudan mukayese edilebilir . In vitro analizi, in vivo gözlenen hatalarının altında yatan hücresel mekanizmaları için bu yöntemi başarılı bir şekilde uygulanması, zaten 12 sunulmuştur .
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma, Amerikan Kalp Birliği hibe 0950118G.to MC-W tarafından kısmen desteklenmiştir.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |