Summary

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Published: March 29, 2011
doi:

Summary

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Abstract

Für viele Zwecke ist der Anbau von Maus-Embryonen ex vivo als organotypischen Schnitten wünschenswert. Zum Beispiel verwenden wir eine transgene Maus-Linie (tauGFP), in dem die verbesserte Version des grün fluoreszierenden Protein (EGFP) exklusiv in allen Neuronen des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems 1 ist ausgedrückt, so dass die Möglichkeit, beide Filme die Innervation das Vorderbein und diesen Prozess mit pharmakologischen und genetischen Techniken 2 zu manipulieren. Die wichtigsten Parameter für die erfolgreiche Kultivierung solcher Scheiben Kulturen ist die Methode, mit der die Scheiben sind vorbereitet. Nach umfangreichen Tests von einer Vielzahl von Methoden, die wir gefunden haben, dass ein Vibratom die bestmögliche Gerät, um die Embryonen, so dass sie routinemäßig in einer Kultur, die Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehreren Tagen und vor allem zeigt, Ergebnis Scheibe ist, entwickelt sich in einem Alter, -spezifischen Art und Weise. Für Mitte der Schwangerschaft Embryonen, schließt dies die normale Folge der Spinalnerven aus dem Rückenmark und Spinalganglien, um ihre Ziele in der Peripherie und die richtige Bestimmung des Skelett-und Muskelgewebe.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode für die Verarbeitung von ganzen Embryonen embryonale Tag (E) E10 bis E12 in 300 bis 400 Mikrometer Scheiben für den Anbau in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator, der für Studium kann bis zu zwei Tage nach slice Vorbereitung. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Verwendung eines Vibratom jedem Agarose eingebettete Embryo in Scheiben schneiden. Dies ist durch den Anbau der Scheiben auf Millicell Kultur Membran-Einsätze auf ein kleines Volumen Medium platziert, wodurch eine Schnittstelle Kultur Technik gefolgt. Ein Wurf mit einem Durchschnitt von 7 Embryonen routinemäßig produziert mindestens 14 Scheiben (2-3 Scheiben von dem Vorderbein Region pro Embryo), das leicht variiert je nach Alter der Embryonen sowie die Dicke der Scheiben. Über 80% der kultivierten Scheiben zeigen Nerven Auswuchs, der througout der Anzucht 2 gemessen werden kann. Repräsentative Ergebnisse mit dem tauGFP Mauslinie demonstriert.

Protocol

Teil 1: Vorbereitung für das Schneiden und Kultivieren. Bereiten 10-cm-Zellkulturplatten mit Slicing (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) und 3-cm Millicell-CM 0,4-um Kultur Membran-Einsätze und halten in Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Hitze bis 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und lassen Sie ihn auf Heizplatte, so dass es bei etwa 37 ° C bleibt Füllen Sie 10-cm bakteriologischen…

Discussion

In einem umfassenden Vergleich von Methoden zur embryonalen Scheibe Kulturen der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen (E10 – E12) vorzubereiten, haben wir beobachtet, dass eine Vibratom ohne Frage stellt die zuverlässigsten Ergebnisse sowohl in Bezug auf die allgemeine Rentabilität der Kulturen und die Reproduzierbarkeit der den Nerv Auswuchs Muster. Im Gegensatz dazu bereit Scheiben mit einem McIlwain Gewebe Chopper 3 erwies sich als völlig lebensfähig. Wir hatten ursprünglich eine Guillotine-Method…

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich die ursprüngliche Quelle für die Idee zu schneiden Kultur auf Maus-Embryonen 5 durchführen. Wir möchten Joachim Kirsch für die großzügige wissenschaftliche Unterstützung und Anna Degen anerkennen für die Tätigkeit als unser Mädchen für alles bei den Dreharbeiten. Und der Universität Heidelberg (Exzellenzcluster Cellular Networks): Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
HBSS 10x   GIBCO 14180  
Dissection tools   FST various  
L.M.P. agarose   Invitrogen 15517-022  
Whatmann paper   Whatman Int. 3030917  
Shortened firepolished pipettes        
DMEM   GIBCO 41966  
FBS   GIBCO 10270-106  
Pen Strep   GIBCO 15140  
L-glutamine 100x   GIBCO 25030  
Vibratome   Microm International GmbH HM 650 V  
Fluorescent microscope   Olympus BX61WI  
analySIS   Soft Imaging System    
Millicell-CM inserts   Millipore PICMORG 50  
10 cm culture plates   Greiner Bio-One 633171  
LOCTITE 406   Henkel 142580  
Razor blades   Thermo Fisher none  
Dissecting microscope   Nikon SMZ800  
HEPES   Roth 9105.2  
Glucose   Sigma G7021  
x4 objective   Olympus PL series  
x10 objective   Olympus UPLFL –PH series  
Filter   Olympus U-MNIBA2  
CCD camera   Soft Imaging System SIS F-View II  
Equipment for heated chamber   Leica CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171  

Riferimenti

  1. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
  2. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
  3. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
  4. Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
  5. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).

Play Video

Citazione di questo articolo
Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (49), e2309, doi:10.3791/2309 (2011).

View Video