Summary

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Published: May 12, 2011
doi:

Summary

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Abstract

Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas através da aplicação de curto RNAs de interferência (siRNAs), plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico vetores 5-7 ou injetar seu alvo, o colículo superior 8. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal desejado sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. Um benefício adicional é a facilidade e precisão com que a sobrevivência da célula podem ser quantificados após a lesão. A retina é um tecido, liso em camadas e RGCs estão localizadas na camada mais interna, a camada de células ganglionares. A sobrevivência da RGCs pode ser rastreado ao longo do tempo através da aplicação de um marcador fluorescente (3% Fluorogold) até o fim do corte do nervo óptico no momento da axotomia, ou pela injeção de traçador no colículo superior (alvo RGC) uma semana antes axotomia. O marcador é transportado retrogradamente, rotulagem toda a população RGC. Porque a camada de células ganglionares é uma monocamada (uma célula de espessura), as densidades RGC podem ser quantificados em tecido liso-montada, sem a necessidade de estereologia. Transecção do nervo óptico leva à morte apoptótica de 90% da RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela de tempo para manipulações experimentais contra vias envolvidas na apoptose.

Protocol

1. Técnica Cirúrgica Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo. 2. Anestesia Ratos serão anestesiados utilizando um …

Discussion

Há muitas variações deste procedimento cirúrgico e vários dos passos neste protocolo não são necessárias. Só é necessário para retrair os músculos que recobrem o nervo óptico, a fim de ganhar acesso ao nervo. No entanto, isso resulta em um espaço muito limitado trabalhando ao redor do nervo fazendo os estágios críticos final da transecção mais difícil. Em certas situações é desejável transfecção as células do tronco do nervo óptico e do espaço maior acesso proporcionada pela retração de tod…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Stereotaxic Frame   Stoelting, Kopf, WPI    
Rat Gas Mask   Stoelting, Kopf, WPI    
Anesthesia System   VetEquip 901806  
Isoflurane (PrAErrane)   Baxter Corp DIN 02225875  
Surgical Microscope   WPI, Zeiss, Leica    
Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)   Sigma 39286  
Gelfoam   Pharmacia & Upjohn    
Tears Naturale P.M.   Alcon    
Proviodine   Medline MDS093945H  
Vannas spring scissors   Fine Science Tools 15000-00  
Fine tip Dumont forceps   Fine Science Tools 11252-00  
Micro surgical hook   Fine Science Tools 10062-12  
Eye dressing serrated forceps   Fine Science Tools 11152-10  
Dumont #7b sharp curved serrated forceps   Fine Science Tools 11270-20  
Cauterizer   Fine Science Tools 18010-00  

Riferimenti

  1. Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
  2. Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
  3. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
  4. Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
  5. Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer. Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).
  6. Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
  7. Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
  8. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscienze. 125, 903-920 (2004).
  9. Berkelaar, M. Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).
  10. Villegas-Perez, M. P. Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 8, 265-280 (1988).
  11. Villegas-Perez, M. P. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
  12. Quigley, H. A. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).
  13. Thanos, S. Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration. Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).
  14. Thanos, S. Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells. Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).

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Citazione di questo articolo
Magharious, M. M., D’Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (51), e2241, doi:10.3791/2241 (2011).

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