Мы описываем а протокол для выделения чистых, высоко связанной сердце крысы митохондрий для функциональных или структурных исследований клеточной биоэнергетики, биофизических измерений, протеомики и митохондриальной ДНК и липидов анализа.
Функция митохондрий в поколение сотовой АТФ в процессе окислительного фосфорилирования широко признается. В течение последнего десятилетия были достигнуты значительные успехи в нашем понимании функции митохондрий, кроме извлечения энергии. К ним относятся их роль в апоптозе, выступая в качестве сигнализации органелл, млекопитающих, развития и старения, а также их вклад в координацию между клеточного метаболизма и пролиферации клеток. Наше понимание биологических процессов модулируется митохондрий основана на надежных методов выделения и обработки интактных митохондрий из тканей лабораторных животных. Митохондрии из сердца крысы является одним из наиболее распространенных подготовке к прошлому и современные исследования клеточного метаболизма в том числе исследования по нокаут животных.
Здесь мы опишем подробную быстрый метод выделения интактных митохондрий с высокой степенью сцепления. Такая подготовка сердце крысы митохондрий является прекрасным объектом для функциональных и структурных исследований на клеточном биоэнергетика, транспорта биомолекул, протеомных исследований и анализа митохондриальной ДНК, белки и липиды.
Подробная быстрым протоколом для изоляции интактных митохондрий с высокой степенью сцепления описана. Полученный препарат может быть использован для функциональные или структурные исследования на клеточном биоэнергетика, протеомных исследований или анализа митохондриальной ДНК и липидов. Биофизические исследования активный транспорт ионов и метаболических промежуточных также может быть выполнена. Вполне возможно, для дальнейшей обработки митохондриальных подготовки, чтобы изолировать СМЧ, наружной мембраны или очистки отдельных компонентов окислительного фосфорилирования. Описанный метод является модификацией стандартного протокола изоляции Якоб и Сакс 1. Ожидаемый выход подготовленной митохондрий составляет около 10-15 мг митохондриального белка на сердце и дыхательный коэффициент на малат / глутамат такого препарата колеблется от 8 до 12 с Государственным IV дыхания около 0,12 мкмоль O 2 Xmin белка -1 xmg -1 при 23 ° С в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ фосфата калия (рН 8,0) с 150 мкМ АДФ для возбуждения дыхания государства III (для точных экспериментальных условиях и дополнениями, см. . 2).
Особое внимание следует уделить несколько технических деталей перед запуском выделения. Крайне важно использовать чистые поликарбоната или трубы полипропиленовые центрифуги, поэтому трубы должны быть тщательно промывают чистой щеткой и горячей водой, однако моющее средство лечения должны находиться на минимум. Кроме того, лучше, чтобы собрать все необходимые посуды и приборов в холодильной камере за день до изоляции.
Во время изоляции при передаче буферов из колб для стаканов, а особое внимание должно быть уделено предотвращению каплями ледяной воды в растворах. При обработке тканей следует подчеркнуть, что сердце добыча должна проводиться как можно скорее, так как даже кратковременная задержка между обезглавливание животных и охлаждение тканей может привести к частичной несвязанных митохондрий. Быстрое охлаждение и тщательное мытье удалены сердца имеет важное значение для получения стандартного препарата, свободные от гемоглобина и эритроцитов NADase.
Трипсин применяется для соединительной деградации белков повышают восприимчивость тканей к поперечной силы при гомогенизации. Длительное воздействие на ткани протеазы следует избегать, поскольку она приводит в митохондриях низкого качества.
После окончания средней скорости центрифугирования стены центрифужные пробирки следует протереть салфеткой, чтобы удалить жировые отложения материала, накопленного на стенах.
Для окончательного ресуспендирования лучше использовать низкий объем окончательного буфера для того, чтобы свести к минимуму потери митохондриальной функции в процессе хранения (от 150 до 200 мкл буфера на сердце). Для изучения транспорта двухвалентных катионов не хелатообразователей должны присутствовать в окончательной подготовки таким образом митохондрии следует мыть несколько раз с EGTA среде без и использовать в течение первых часов после изоляции.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора А. Виноградов и доктор Вера Grivennikova для внедрения авторам области митохондриальной биологии и много полезных идей и советов в этой процедуре. Авторы выражают благодарность г-жа Аманда McKintock из Королевского университета СМИ офис за помощь в подготовке видео.