Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.
Die Funktion der Mitochondrien bei der Erzeugung von zellulären ATP in den Prozess der oxidativen Phosphorylierung wird allgemein anerkannt. In den vergangenen Jahrzehnten gab es bedeutende Fortschritte in unserem Verständnis der Funktionen der Mitochondrien anderes als die Erzeugung von Energie worden. Dazu gehören ihre Rolle bei der Apoptose, als Signalisierung Organellen, Säugetieren und des Alterns sowie deren Beitrag zur Koordination zwischen den Zellstoffwechsel und die Zellproliferation. Unser Verständnis von biologischen Prozessen moduliert durch Mitochondrien ist auf robuste Methoden zur Isolierung und Behandlung von intakten Mitochondrien aus dem Gewebe der Versuchstiere auf. Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels, einschließlich Studien zur Knock-out-Tiere.
Hier beschreiben wir eine detaillierte schnelle Methode zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung. Eine solche Vorbereitung von Ratten-Mitochondrien ist ein hervorragendes Objekt für funktionelle und strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Transport von Biomolekülen, Proteom-Studien und Analysen der mitochondrialen DNA, Proteine und Lipide.
Detaillierte schnelle Protokoll zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung beschrieben. Erhalten Vorbereitung für eine funktionale oder strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Proteom-Studien oder Analysen der mitochondrialen DNA und Lipid-Gehalt verwendet werden. Biophysikalische Untersuchungen von aktiven Transport von Ionen und Stoffwechsel-Zwischenprodukte können auch durchgeführt werden. Es ist möglich, weitere Prozess der mitochondrialen Vorbereitung, um submitochondrialen Partikeln, äußere Membran oder Reinigung einzelnen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung zu isolieren. Das beschriebene Verfahren ist eine Modifikation des Standard-Protokoll der Isolation von Jacobus und Saks 1. Die erwartete Rendite des präparierten Mitochondrien beträgt ca. 10-15 mg der mitochondrialen Protein pro Herzens und der Atmung kontrollieren Verhältnis auf Malat / Glutamat für diese Zubereitung variiert zwischen 8 bis 12 mit der staatlichen IV Atmung von rund 0,12 mmol O 2 xmin -1 XMG Protein -1 bei 23 ° C in das Medium mit 0,25 M Saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM Kaliumphosphat (pH 8,0) mit 150 uM ADP für die Einleitung Staat III Atmung (für die genauen experimentellen Bedingungen und Ergänzungen, siehe Lit. . 2).
Besonderes Augenmerk sollte auf einige technische Details vor Beginn der Isolierung Verfahren gegeben werden. Es ist wichtig zu reinigen Polycarbonat oder Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verwenden, also Röhren sollten gründlich mit einem sauberen Bürste und heißem Wasser, aber das Waschmittel sollte die Behandlung mit dem Minimum gehalten werden gewaschen werden. Außerdem ist es besser, alle notwendigen Glaswaren und Instrumente in den kalten Raum zu sammeln einen Tag vor der Isolation.
Während der Isolation bei der Übertragung von Puffern aus Flaschen zu Bechern, sollte а besonderes Augenmerk auf die Tropfen Eiswasser in die Lösungen zu verhindern. Beim Umgang mit Geweben es sollte betont werden, dass Herz-Extraktion sollte so bald wie möglich, da selbst kurze Zeitverzögerung zwischen Enthauptung des Tieres und Kühlung des Gewebes würde in teilweise abgekoppelt Mitochondrien Ergebnis durchgeführt werden. Schnelle Kühlung und gründliches Waschen der entfernt Herz ist von wesentlicher Bedeutung, um Standard-Vorbereitung, frei von Hämoglobin und Erythrozyten NADase erhalten.
Trypsin ist für Binde-Proteine Abbau verwendet werden, um die Anfälligkeit des Gewebes auf Scherkraft Anstieg während der Homogenisierung. Längere Exposition des Gewebes Protease sollte vermieden werden, da es in den Mitochondrien von minderer Qualität führt werden.
Nach High-Speed-Zentrifugationen den Wänden der Röhrchen sollten mit Seidenpapier abgewischt werden, um Ablagerungen von Fett Material an den Wänden angesammelt entfernen.
Für die endgültige Resuspension ist es besser, ein geringes Volumen des fertigen Puffer zu nutzen, um Verluste zu minimieren der mitochondrialen Funktionen während der Lagerung (150 bis 200 ul des Puffers pro Herz). Für Untersuchungen der Transport von zweiwertigen Kationen keine Chelatbildner vorhanden sein muss in den letzten Vorbereitungen so Mitochondrien sollte mehrmals mit EGTA-freiem Medium gewaschen und verwendet werden, innerhalb der ersten Stunden nach der Trennung.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Prof. A. Vinogradov und Dr. Vera Grivennikova für die Einführung der Autoren auf dem Gebiet der mitochondrialen Biologie und viele nützliche Einsichten und Ratschläge in diesem Verfahren. Die Autoren bedanken sich bei Frau Amanda McKintock von der Queens University Medien Büro für die Hilfe bei der Video-Vorbereitung.