우리는 세포 bioenergetics, biophysical 측정, proteomics 또는 mitochondrial DNA와 lipids 분석의 기능이나 구조 연구 mitochondria 순수, 높은 결합 쥐 심장의 절연을위한 а 프로토콜을 설명합니다.
산화 인산화 과정에서 세포 ATP의 생성에 mitochondria의 기능은 널리 인정되고 있습니다. 지난 수십 년 동안 에너지의 생성보다 mitochondria 기타의 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 진보가 있었있다. 이러한 organelles, 포유류의 개발을 신호 및 세포 대사 및 세포 증식 사이의 협력에 자신의 기여뿐만 아니라 노화 역할, apoptosis의 역할을 포함합니다. mitochondria에 의해 변조된 생물 학적 과정에 대한 우리의 이해는 고립과 실험실 동물의 조직에서 손상 mitochondria의 취급에 대한 강력한 방법을 기반으로합니다. 쥐의 심장에서 Mitochondria 노크 아웃 동물 연구를 포함하여 세포 대사의 과거 및 현재 연구에 대한 가장 일반적인 준비의 하나입니다.
여기 커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 신속한 방법을 설명합니다. mitochondria 쥐 심장의 이러한 준비 셀룰러 bioenergetics, mitochondrial DNA, 단백질 및 lipids의 biomolecules, proteomic 연구 및 분석의 교통에 대한 기능 및 구조 연구를위한 훌륭한 개체입니다.
커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 급속한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 획득 준비는 셀룰러 bioenergetics, proteomic 연구 또는 mitochondrial DNA와 지질 콘텐츠의 분석 기능이나 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이온과 신진 대사 중간체의 적극적인 교통 Biophysical 연구도 수행할 수 있습니다. 그것은 더 submitochondrial 입자, 바깥쪽 막이나 산화 인산화의 정화 별도의 구성 요소를 분리하기 위해 mitochondrial 준비를 처리할 수 있습니다. 설명한 방법은 제이 코 버스와 삭스 1 고립의 표준 프로토콜의 수정입니다. 준비 mitochondria의 예상 수확량은 마음 당 mitochondrial 단백질과 malate / 등 준비 글루 탐 산염은 간의 차이에 대한 호흡 관리 비율의 약 10-15 MG는 0.12 주위 μmol O 2 xmin -1 xmg 단백질의 주 IV의 호흡과 함께 8-12 23 -1 ° 0.25 M의 자당, 10 MM KCl, 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 초기화 상태 III의 호흡 150 μm의의 ADP (정확한 실험 조건 및 추가에 대한 심판을 참조하십시오 5 MM의 칼륨 나트륨 (산도 8.0)를 구성된 매체 C 2.).
특별한주의는 격리 절차의 시작하기 전에 몇 가지 기술적인 세부 정보를 제공해야합니다. 그것은 깨끗한 폴리 카보 네이트 또는 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브를 사용하는 데있어 매우 중요합니다, 따라서 튜브는 철저하게 깨끗한 칫솔과 온수, 그러나 세제 치료를 최소한으로 유지되어야 함께 세탁해야합니다. 또한, 그것은 고립되기 전에 하루 추운 방에 필요한 모든 유리와 악기를 수집하는 것이 좋습니다.
절연 동안 비커에 flasks에서 버퍼를 전송할 때, а 특별한주의가 솔루션에 얼음 물이 방울을 방지하기 위해 제공해야합니다. 조직을 다룰 때 그것은 심장 추출이 동물의 잘린 및 조직을 냉각 사이에도 짧은 시간 지연이 부분 uncoupled mitochondria을 초래 하리라는 사실 때문에 가능 한한 빨리 수행되어야한다는 것을 강조해야합니다. 신속한 냉각 및 제거 마음의 철저한 세척는 헤모글로빈과 적혈구 NADase에서 무료로 표준 준비를 얻기 위해 필수적입니다.
트립신은 homogenisation 중 전단의 강제로 조직의 자화율을 높일 결합 단백질의 저하에 사용됩니다. 그것이 열등 품질의 mitochondria 결과 이후 프로 테아제에 대한 조직의 장시간 노출을 피해야한다.
고속 centrifugations 후 원심 분리기 튜브의 벽은 벽에 축적된 지방 소재의 예금을 제거 티슈로 닦아해야합니다.
최종 resuspension의 경우는 저장 (심장 당 버퍼 150-200 μl) 동안 mitochondrial 기능의 손실을 최소화하기 위해 최종 버퍼의 낮은 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 이가의 양이온의 수송 연구에 대한 chelating 요원들이 EGTA 무료 매체를 여러 번 씻어 및 절연 후 첫번째 시간 이내에 사용해야하므로 mitochondria 최종 준비에 존재이어야합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 프로 시저에 mitochondrial 생물학 많은 유용한 통찰력과 조언의 분야에 대한 저자의 소개 교수 A. Vinogradov 및 박사 베라 Grivennikova 감사합니다. 저자는 비디오 준비 도움 퀸즈 대학교 미디어 사무실에서 부인 아만다 McKintock에게 감사하고 있습니다.