وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.
ومن المعترف به على نطاق واسع وظيفة الميتوكوندريا في توليد ATP الخلوية في عملية الفسفرة المؤكسدة. خلال العقود الماضية لم يكن هناك تقدم كبير في فهمنا لوظائف أخرى من الميتوكوندريا توليد الطاقة. وتشمل هذه دورها في موت الخلايا المبرمج ، بوصفها إشارات العضيات ، والتنمية في الثدييات والشيخوخة ، فضلا عن مساهمتها في التنسيق بين الخلايا والأيض تكاثر الخلايا. ويستند فهمنا من العمليات البيولوجية عن طريق التضمين الميتوكوندريا على أساليب العزل وقوية لمعالجة سليمة الميتوكوندريا من الأنسجة من الحيوانات المختبرية. الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية بما في ذلك دراسات على الحيوانات ، بالضربة القاضية.
نحن هنا وصف مفصل الأسلوب السريع لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. هذا النوع من التحضير لقلب فأر الميتوكوندريا هو كائن ممتازة للبحوث الفنية والهيكلية على الطاقة الحيوية الخلوية ، ونقل الجزيئات الحيوية ، ودراسات وتحليل البروتين الحمض النووي والبروتينات والدهون.
يوصف بروتوكول السريع مفصلة لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. ويمكن استخدام إعداد البحوث الفنية التي تم الحصول عليها لأو الهيكلي على الطاقة الحيوية الخلوية ، والدراسات البروتين أو تحليل الحمض النووي والمحتوى الدهني. ويمكن أيضا للدراسات البيوفيزيائية النقل النشط للأيونات وسيطة الأيضية أن يؤديها. فمن الممكن لعملية إعداد مزيد من الميتوكوندريا من أجل عزل جزيئات submitochondrial ، الغشاء الخارجي أو مكونات منفصلة تنقية الفسفرة المؤكسدة. وصف الأسلوب هو تعديل للبروتوكول قياسي من العزلة التي وجاكوبوس ساكس 1. العائد المتوقع من الميتوكوندريا أعد ما يقرب من 10-15 ملغ من البروتين الميتوكوندريا في القلب والجهاز التنفسي نسبة السيطرة على مالات / الغلوتامات إعداد مثل هذه تختلف ما بين 8 إلى 12 مع تنفس رابعا الدولة نحو 0.12 μmol O البروتين xmin xmg 2 -1 -1 عند 23 درجة مئوية في المتوسط تضم السكروز 0.25 م و 10 ملي بوكل ، EDTA 0.2 ملم ، 5 فوسفات البوتاسيوم ملم (8.0 درجة الحموضة) مع ADP 150 ميكرومتر لبدء التنفس ثالثا الدولة (للظروف الدقيقة والإضافات التجريبية ، انظر المرجع 2).
وينبغي إيلاء اهتمام خاص لالتفاصيل التقنية قبل عدة بدءا من إجراءات العزل. فمن الأهمية بمكان أن الاستخدام النظيف البولي بروبلين أو أنابيب الطرد المركزي ، وبالتالي ينبغي أنابيب غسلها جيدا بفرشاة نظيفة والماء الساخن ، ولكن ينبغي أن تظل معاملة المنظفات في الحد الأدنى. أيضا ، فمن الأفضل لجمع كل الأواني والأدوات اللازمة في الغرفة الباردة قبل يوم من العزلة.
خلال العزلة عندما نقل إلى مخازن قوارير من الأكواب ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص а لمنع قطرات من الماء المثلج في الحلول. يجب عند التعامل مع الأنسجة ينبغي التشديد على أنه ينبغي أن يتم استخراج القلب في أقرب وقت ممكن حتى منذ فترة قصيرة من التأخير بين انفصال رأس الحيوان وتبريد الأنسجة من شأنه أن يؤدي في الميتوكوندريا uncoupled جزئيا. التبريد السريع والغسل الكامل للقلوب إزالة أمر ضروري للحصول على إعداد المعيار ، وخالية من خضاب الدم وكرات الدم الحمراء NADase.
يستخدم التربسين عن تدهور البروتينات الضام لزيادة حساسية الأنسجة للقوة القص خلال التجانس. وينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة من النسيج البروتيني لأنها نتيجة في الميتوكوندريا من نوعية رديئة.
وينبغي بعد centrifugations عالية السرعة أن تمحى من على الجدران أنابيب الطرد المركزي مع المناديل الورقية لإزالة أي رواسب من المواد الدهون المتراكمة على الجدران.
لإعادة تعليق النهائي فإنه من الأفضل استخدام حجم منخفض من المنطقة العازلة النهائية من أجل تقليل الخسائر في الوظائف الميتوكوندريا أثناء التخزين (150 الى 200 ميكرولتر من المنطقة العازلة في القلب). لإجراء دراسات حول نقل الكاتيونات ثنائي التكافؤ يجب أن أية عوامل مخلبية تكون موجودة في الميتوكوندريا الإعداد النهائي وبالتالي يجب غسلها عدة مرات مع EGTA خالية المتوسطة واستخدامها في غضون ساعات الأولى بعد العزلة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الأستاذ الدكتور أ. فينوجرادوف وGrivennikova فيرا لإدخال الكتاب في ميدان البيولوجيا الميتوكوندريا ورؤى كثيرة مفيدة والمشورة في هذا الإجراء. المؤلفون ممتنون السيدة أماندا McKintock من مكتب جامعة كوينز وسائل الإعلام للمساعدة في إعداد الفيديو.