I livmodern elektroporation följt av primär Neuronala Kultur för att studera geners funktion i Delmängd av kortikal Neuroner
Summary
I livmodern elektroporation är en värdefull metod för transfecting neuronala stamceller in vivo. Beroende på placering av elektroderna och utvecklingsmässiga tidpunkterna för elektroporation kan vissa delmängder av kortikala celler riktas. Riktade celler kan sedan analyseras in vivo eller in vitro för effekterna av genetiska förändringar.
Abstract
In vitro-studier av primära neuronala kulturer möjliggör kvantitativa analyser av neurite utväxt. För att studera hur genetiska förändringar påverkar neuronala processen utväxt, shRNA eller cDNA konstruktioner kan införas i primär nervceller via kemiska transfektion eller viral transduktion. Men med primär kortikala celler, är en heterogen grupp av celltyper (glutamaterg nervceller från olika lager, hämmande nervceller, gliaceller) transfekterade med dessa metoder. Användningen av i livmodern elektroporering att införa DNA-konstruktioner i den embryonala gnagare cortex tillåter vissa grupper av celler som utgör målgrupp: medan elektroporering av tidiga embryonala cortex mål djupa lagren av hjärnbarken, mål elektroporation på sena embryonala tidpunkter mer ytliga lager. Vidare differential placering av elektroder över huvudet på enskilda embryon resulterar i att rikta dorsal-mediala kontra ventral-laterala områden av hjärnbarken. Efter elektroporation kan transfekterade celler dissekeras ut, dissocierade, och pläterade in vitro för kvantitativ analys av neurite utväxt. Här ger vi en steg-för-steg metod för att kvantitativt mäta neuronala processen utväxt i delmängder av kortikala celler.
Den grundläggande protokoll för i livmodern elektroporering har beskrivits i detalj i två andra JUPITER artiklar från Kriegstein lab 1, 2. Vi kommer att ge en översikt över våra protokoll för i livmodern elektroporering, med fokus på de viktigaste detaljerna, följt av en beskrivning av våra protokoll som gäller i livmodern elektroporering till att studera geners funktion i neuronala processen utväxt.
Protocol
Discussion
In vitro-studier av primära neuronala kulturer möjliggör kvantitativa analyser av neurite utväxt. För att studera hur genetiska förändringar påverkar neuronala processen utväxt kan shRNA eller misexpression konstruktioner skall införas i primära neuroner via kemiska transfektion eller viral transduktion. Men med primär kortikala celler, är en heterogen grupp av celltyper (glutamaterg nervceller från olika lager, hämmande nervceller, gliaceller) transfekterade med dessa metoder. Användningen av <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Josef LoTurco och Dennis Selkoe för bra diskussioner om denna teknik. Författarna tackar givarna av den amerikanska hälso-och sjukvård stiftelse för att stödja denna forskning.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Riferimenti
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
