utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에
Summary
utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.
Abstract
기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 허용합니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결 가지, shRNA 또는 cDNA 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 도입 수있는 영향을 미치는지 연구하기 위해. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 이러한 방법을 사용 transfected 있습니다. 배아 쥐 대뇌 피질의 DNA 구조를 소개 utero의 electroporation에의 사용 대상으로 세포의 특정 하위 집합을 허용 : 피질의 초기 배아 피질 대상 깊은 레이어 electroporation은 늦은 배아 timepoints에 electroporation은 더 많은 외면적인 레이어를 대상으로하면서. 또한, 피질의 지느러미 – 중간 대 복부 – 가로 영역의 대상에서 개별 배아 결과의 머리를 통해 전극의 차등 배치. electroporation 다음, transfected 세포는 밖으로 해부 dissociated와 neurite 가지의 정량 분석을 위해 체외에서 도금 수 있습니다. 여기, 우리는 양적 대뇌 피질 세포의 하위 집합에의 연결 프로세스 가지를 측정하기위한 단계별 방법을 제공합니다.
utero의 electroporation에 대한 기본적인 프로토콜은 Kriegstein 연구실 1, 2에서 두 개의 다른 조브 기사에 자세히 설명되어있다. 우리의 연결 프로세스 가지의 유전자 기능 연구에 utero의 electroporation에 적용의 프로토콜에 대한 설명 다음에 가장 중요한 세부 사항에 초점을 utero의 electroporation에 우리의 프로토콜의 개요를, 제공할 것입니다.
Protocol
Discussion
기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 위해 수 있습니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결을 가지 영향을 미치는지 연구하기 위해, shRNA 또는 misexpression 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 소개하실 수 있습니다. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 기술에 대한 유용한 토론 요셉 LoTurco과 데니스 Selkoe 감사하고 싶습니다. 저자는이 연구의 지원, 미국의 건강 보조 재단의 기부자 감사합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Riferimenti
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
