ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、キメラの生産のためのイメージングと細胞移植のためにアガロースに取付け、dechorionation含むメダカ胚を操作する方法のためのステップバイステップの手順を示しています。これらの手順は、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のためにそれらの補完的な機能をフルに活用するために実験室でのメダカとゼブラフィッシュを使用するために不可欠です。
メダカは、遺伝子と発生学の両方の分析を可能にし、ゲノムワイドな表現型主導型の変異体の画面が1を実施された3つの脊椎動物のモデル生物の一つである小規模な産卵淡水魚です。メダカとゼブラフィッシュの間に関連する遺伝子の機能重複の相違は、単一の種2の識別不能な新規な表現型の同定を可能にする、このようにメダカとゼブラフィッシュは、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のための補完的です。このようなdechorionationとしてメダカ胚の操作、画像処理および細胞移植のためのマウント胚は、研究室でメダカとゼブラフィッシュの両方で動作する主要な手順です。細胞移植は、メダカの突然変異の細胞の自律性を調べます。キメラは、ラベルのないレシピエント胚にドナー胚からの標識された細胞を移植することにより生成されます。ドナー細胞を移植された細胞からのクローンが開発中の関心の組織に統合できるように、運命のマップ3に基づいて受信者の胚の特定の領域に移植することができる。ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、我々は、メダカの胚を操作するための詳細な手順を示しています。
このビデオでは、dechorionateとメダカ胚の細胞のtransplanataionを実施する方法を示します。これは、問題の遺伝子/タンパク質の自律性を解明するためだけでなく、開発中の遺伝子/タンパク質機能の研究のためのキメラ胚を作成する強力な手法です。メダカは、 生体内リアルタイムイメージングのためにも、それらを貸す十分に確立された運命のマップとその透明性のためにこのテクニックのための有用な脊椎動物モデル系です。移植は、移植細胞の挙動を容易に観察できるようにマイクロインジェクション(添付のJoveのプロトコル"メダカ胚のマイクロインジェクション"に記載されている)と組み合わせることができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、MRCからM. FSへの助成金によってサポートされています。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Embryo medium | Reagent | Made in-house | N/A | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.) |
Micro-dissecting forceps | Tools | 55 INOX A.DUMONT&FILS | N/A | Very sharp fine tips for removal of chorion. |
Fine waterproof sandpaper – p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | N/A | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. |
3% methylcellulose | Reagent | Sigma | M 0512 | High viscosity for holding embryos in place during transplantation. |
1X BSS | Reagent | Made in-house | N/A | 20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use. |
Penicillin-streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | Added to BSS when incubating dechorionated embryos. |
Pronase | Reagent | Calbiochem | 53702 | For dechorionation. |
Hatching enzyme | Reagent | Made in-house | N/A | For dechorionation. |
Tricaine mesilate (TMS) | Reagent | Sigma | A-5040 | 400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water. |
3% ultra-low gelling temp. agarose | Reagent | Sigma | A-2576 | Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation. |
Petri dish culture chamber | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 11-004-008 | Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation. |
Micromanipulator | Equipment | Narishige | N/A | Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation. |
Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10T | For making transplantation needles. |
Flaming/Brown micropipette puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | For making transplantation needles. |