Generación de mamosferas primarias: una técnica para determinar la potencia celular

1. Generación de mamosferas primarias de líneas celulares de cáncer de mama humano

NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una capucha de cultivo estéril.

1. Preparar medios de mamosfera que contengan DMEM/F12 complementados con 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina. Preparar medios completos inmediatamente antes de su uso añadiendo 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF; Sigma), 10 ng/ml recombinante factor de crecimiento de fibroblastos básicos humanos (bFGF; Sistemas de I+D) y suplemento 1x B27.
2. Aspirar medios del matraz que contengan células MCF-7 o MDA-MB-231 adherentes (o una línea celular de cáncer de mama de su elección; 70-80% de confluencia), lavar dos veces en 1 PBS y probar células.
3. Células centrífugas a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Células supernadantes y resuspend en 1-5 ml de medios mamosfera. Pipeta arriba y abajo y si es necesario utilice un filtro de tapa de colador de celda de 40 μm para obtener la suspensión de una sola célula. Utilice un hemociclo para asegurarse de que se ha formado una sola suspensión celular (si no, utilice una aguja de 25 G para jeringa la suspensión celular hasta 3 veces).
4. Si es necesario, aísle el subconjunto celular CD44+CD24- a través de FACS utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD24-ficoeriterrina (PE) y anti-CD44-fluorescenato isoticianato (FITC) monoclonal⁹. Alternativamente, aísle dicha población utilizando un sistema de clasificación celular activado magnéticamente (MACS) con microperlas combinadas anti-CD44 y anti-CD24-biotina según las instrucciones del fabricante. Realice una selección positiva utilizando columnas LS y selección negativa utilizando columnas LD y confirme los fenotipos de todas las células aisladas por citometría de flujo.
5. Calcule el número de celdas viables por ml utilizando trypan blue.
   NOTA: La viabilidad celular se calcula como el número de células viables divididas por el número total de células dentro de las cuadrículas en el hemociclo. Las células que toman trypan azul se consideran no viables. El siguiente procedimiento se utiliza para determinar con precisión la proporción de células viables.
   1. Prepare una solución del 0,4% de trypan blue en PBS. Añadir 0,1 ml de solución de material azul trypan a 1 ml de células. Cargue un hemociclo y examine inmediatamente bajo un microscopio a baja ampliación. Cuente el número total de células y el número de células manchadas azules. Celdas viables = [1.00 – (Número de celdas azules ÷ Número de celdas totales)] × 100.
   2. Para calcular el número de células viables por ml de cultivo, utilice la siguiente fórmula. Recuerde corregir el factor de dilución.
      Número de células viables × 10⁴ × 1.1 = cultivo de células/ml
6. Resuspend una cantidad predeterminada de células en 2 ml de medios mamosferos completos en cada pozo de una placa adherente ultrabata de 6 pozos. La densidad de siembra es normalmente de 500-4.000 células/cm² células por pozo. Opcionalmente, utilice placas de 24 pozos de fijación baja mientras sembran celdas con la misma densidad en 0,5 ml de medios.
   NOTA: Recomendamos la optimización de la densidad de siembra y el tiempo de cultivo para cada línea de interés de celda.
7. Incubar placas ultrabajos de 6 pozos a 37 °C y 5% CO₂ durante 5-10 días (dependiendo de la línea celular y el tamaño de las mamosferas) sin perturbar las placas, particularmente durante la fase de crecimiento de los primeros 5 días.