C. elegans Besleme için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA İfadesini Teşvik Etmek İçin Bir Teknik
Published: April 30, 2023
Abstract
Kaynak: Kolundzic, E., vd. Mikrop Hücrelerini C. elegans’takiNöronlara Yeniden Programlamak için RNAi ve Isı şoku kaynaklı Transkripsiyon Faktörü ekspresyonunun uygulanması. J. Vis. Exp. (2018).
Bu video, C. elegans’ta RNAi tedavisinin arkasındaki ilkeleri açıklar ve transgenik bir solucan suşunda lin-35’i devirmek için bir protokol göstermektedir.
Protocol
Bu protokol Kolundzic, ve diğerleri,RNAi uygulaması ve ısı şoku kaynaklı Transkripsiyon Faktörü İfadesi’nden alıntılanmıştır Germ Hücrelerini C. elegans, J. Vis.Exp’teki Nöronlara Yeniden Programlamakiçin. (2018). Çözüm Hazırlama NGM-Agar plakaları (1 L) 3 g NaCl, 2,5 g pepton ortamı (ör…
Representative Results
Şekil 1: RNAi’nin lin-53’e karşı neden olduğu pvul fenotip. (Üstte) Kontrol veya lin-53 RNAi tedavi annelerinden elde edilen L4 /genç yetişkin evre F1 soy solucanlarının DIC resmi. Ölçek çubukları = 20 μm. (Alt) Lin-53 RNAi ile tedavi edilen hayvanlar çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini (siyah ok kafaları) gösterir. Pvul fenotipi, lin-53’e ka…
Materials
| Chemicals | |||
| Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
| Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
| Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
| Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
| CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
| Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
| Gelatine | Roth | 4275.3 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| K2PO4 | Roth | T875.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
| NaCl | Roth | 9265.1 | |
| NaClO | Roth | 9062.3 | |
| NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
| Tris | Roth | AE15.2 | |
| Carbenicillin | Roth | 634412 | |
| Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
| Incubators | |||
| Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
| Microscopes | |||
| Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
| Bacterial strains | |||
| Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus). | ||
| Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
| Worm strains | |||
| BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. | derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
| RNAi Clones | |||
| lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
| empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 |
Citazione di questo articolo
RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20138, doi: (2023).