פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.
Summary
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.
Abstract
אנו להדגים את היישום של התמונה מבוססי מתודולוגיה גבוהה תוכן ההקרנה (HCS) כדי לזהות מולקולות קטנות שיכולות לווסת את מסלול FGF / RAS / MAPK עוברי דג הזברה. העובר דג הזברה הוא אידיאלי עבור מערכת ב-high-vivo תוכן מסכי כימיים. עובר יום 1 הישן הוא כ 1 מ"מ בקוטר יכול להיות ערוכים בקלות לתוך צלחות 96, טוב, פורמט סטנדרטי עבור הקרנת תפוקה גבוהה. במהלך היום הראשון של הפיתוח, עוברים הם שקופים עם רוב האיברים העיקריים הנוכחי, ובכך לאפשר הדמיה של היווצרות רקמות במהלך embryogenesis. אוטומציה מלאה של מסכי דג הזברה כימי הוא עדיין אתגר, לעומת זאת, במיוחד בפיתוח של רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. אנחנו קודם שנוצר קו כתב מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של פעילות FGF והפגינו השירות שלהם מסכי כימיים<sup> 1</sup>. כדי ליצור מתודולוגיה גבוהה מסכי התפוקה כל אורגניזם, פיתחנו מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה ב 24-48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) ב 96-גם צלחות<sup> 2</sup>. בסרט זה אנו מדגישים את הליכי עריכה עוברים מהונדס לתוך צלחות multiwell ב 24hpf ועל תוספת של מולקולה קטנה (BCI) כי hyperactivates FGF איתות<sup> 3</sup>. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות לאחר מכן על ידי תוספת של tricaine להרדים הזחלים לפני הדמיה אוטומטית על התקנים מולקולריים ImageXpress Ultra סריקת לייזר confocal HCS הקורא. תמונות מעובדים על ידי תוכנה המפתחים Definiens באמצעות רשת קוגניציה וטכנולוגיה האלגוריתם שפיתחנו כדי לזהות ולכמת ביטוי של GFP על ראשיהם של עוברי מהונדס. בדוגמה זו אנו מדגישים את היכולת של האלגוריתם כדי למדוד מינון תלויי השפעות BCI על הביטוי העיתונאי GFP גנים העוברים טיפול.
Protocol
Discussion
הגורם העיקרי המגביל את התפוקה של מסכי דג הזברה כימיים היא חוסר מתודולוגיה לתהליך שיטתי 96-גם צלחות עבור הדמיה וניתוח. בגלל תמונות של אורגניזמים תאיים הם בניגוד מורכבים, נמוך, הטרוגנית בטבע, קיים ניתוח אלגוריתמים התמונה מצליחים לזהות ולכמת מבנים ספציפיים בתוך האורגניזם. רוב שפורסם כימיים מסכי דג הזברה ולכן כרוך בדיקה ויזואלית של בארות הפרט על ידי אנשי מוקדש בכל ההליך. בדרך כלל זה מונע את הדור של readouts מספרית מוחלטת בארכיון של תמונות מסך ונתונים. יתר על כן, הערכה ידנית מבטלת יתרונות מרכזיים של ההקרנה מבוססות תמונה, כלומר את היכולת לנהל ניתוח רטרוספקטיבי של ביצועי המסך, כדי לבחון שינויים פנוטיפי שלא היו המוקד העיקרי של הקמפיין ההקרנה (למשל, רעילות או ליקויים התפתחותיים) ו לחצות הפניה ההקרנה נתונים עם מסכי בעבר או בעתיד באמצעות ספריה המתחם זהה.
בדו"ח זה אנו מדגישים מתודולוגיה הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה בצלחות multiwell ללא התערבות המשתמש. אנחנו ללכוד תמונה אוטומטית על לייזר ImageXpress Ultra סריקה confocal הקורא (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) לתמונה Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים 96 צלחות היטב פיתחה אלגוריתם עיבוד תמונה מבוסס על טכנולוגיה "Definiens רשת קוגניציה כי GFP לכמת ביטוי את ראשיהם של עוברי מהונדס. השיטה מועברת התגובות מדורגים לכמת בפעילות vivo של מולקולה קטנה activator של FGF איתות. תוצאות דומות התקבלו עם epifluorescence מבוססי ArrayScan II (Cellomics Inc, פיטסבורג רש"פ) המתעדים כי ניתן ליישם לכידת תמונה אוטומטי של עוברי דג הזברה על מגוון רחב של קוראי צלחת זמינים מסחרית 2. פיתוח המתודולוגיה באופן אוטומטי לנתח תמונות אורגניזם רב לבטל את הצורך הבקיע חזותי על ידי הצופה האדם ואפשרה את הדור בארכיון של נתונים מספריים תמונות לניתוח רטרוספקטיבי השוואות עם מסכי בעתיד.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי NICHD / NIH (1R01HD053287) כדי Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) כדי ווגט, NHLBI ו / NIH (1R01HL088016) כדי צאנג.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |
Riferimenti
- Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).
