Summary

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Published: July 14, 2010
doi:

Summary

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ<sub> 1-42</sub> Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ<sub> 1-42</sub> Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.

Abstract

Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica<sub> 1-42</sub>. Então, seguimos uma experiência individual na qual LTP é reduzida em fatias hipocampais expostas a Aâ oligomerized<sub> 1-42</sub> Em comparação com fatias em um experimento de controle, onde não Aâ<sub> 1-42</subExposição> tivesse ocorrido.

Protocol

Ressuspensão peptídeo β-amilóide Antes de começar tenho pronto: Aâ 1-42 (pó liofilizado) 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml) Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL) Dimetilsulfóxido (DMSO) Permitir Aâ liofilizado 1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensaç…

Discussion

Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blot…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442).>

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Aβ 1-42 (lyophilized)   American Peptide Co. 62-0-80  
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)   Fluka 52517  
Dimethylsulfoxide (DMSO)   Biotium 90082  
50mL Polypropylene Centrifuge Tubes   Corning 05-538-67  
1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery   Axygen MCT-150-L-C  
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4   Invitrogen-Gibco 10010-023  
GASTIGHT Syringes 250 μL   Hamilton 1725  
Bath sonicator   Branson 3510  
Savant SpeedVac Concentrator System   Various distributors SC 110A  

Riferimenti

  1. Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
  2. Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
  3. Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
  4. Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
  5. Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer’s disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
  6. Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
  7. Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
  8. Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
  9. Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
  10. Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
  11. Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).

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Citazione di questo articolo
Fa, M., Orozco, I. J., Francis, Y. I., Saeed, F., Gong, Y., Arancio, O. Preparation of Oligomeric β-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices. J. Vis. Exp. (41), e1884, doi:10.3791/1884 (2010).

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