蛋白转导使进入细胞的生物活性蛋白的直接传递。相反,如DNA转染或病毒转导的传统方法,这种非侵入性的范式允许在滴定的细胞毒性和永久性的基因改造的致癌转化的风险规避方式高效蜂窝操作。
蛋白转导技术,使哺乳动物细胞的生物活性物质的直接交付[ 复查见 1,2 ]。对于这种人可以使用所谓的细胞穿透肽(CPPS)的转位能力,也被指定为蛋白转导域(PTD的)。 TAT – CPP的由人类免疫缺陷病毒1型(HIV – 1)达(反转录激活)蛋白已被广泛应用于派生。带正电的达促进细胞的通透性,从 而克服障碍的细胞膜内吞作用和/或直接膜渗透2。结合核定位信号(NLS)的融合蛋白能够进入细胞核展示功能。我们的视频演示表明,作为细胞渗透蛋白质工程,施工,生产和应用一个细胞的DNA修饰酶Cre重组透水版本的例证。
CRE是一个特定地点的重组,能够识别和重组在哺乳动物细胞在体外和体内的34个碱基对loxP位网站。因此的Cre / loxP系统被广泛用于有条件地诱导在活细胞3,4的基因组的突变。然而,传递到细胞积极Cre重组的限制。
我们描述的pSESAME载体系统,它允许一个直接插入的基因利益,并提供了一个平台,可迅速克隆不同的域和向量的内标签在一个方便的和标准化的方式使用。重新安排不同的标记已被证明修改的融合提供了可能性,以达到更高的的产量和更好的溶解度蛋白的生化特性。我们演示了如何表达和纯化在大肠杆菌和重组细胞的permeant蛋白。在细胞培养的Cre重组蛋白的功能最终验证评估其细胞内的重组活动。
在Cre重组融合蛋白的纯化过程,重要的是不要忽略除了冰冷的TBS缓冲液离心前。否则Cre重组甘油缓冲区内趋于沉淀。
如果洗脱液分数似乎变得混浊由于融合蛋白额外的洗脱缓冲液的高浓度应增加,直到解决方案已被清除再次。
Cre重组融合蛋白的10微米的应用通常会导致重组效率在80%至100%。小牛血清(FCS)的ES细胞的培养基中的重要组成部分,强烈地抑制蛋白转导。因此Cre重组酶的高浓度,必须使用。在无血清的条件下工作时,可以使用较少的蛋白质(0.5 – 2微米)来实现类似的重组效率。
与手头pSESAME载体系统,可以适用于其他蛋白质,包括转录因子,如Oct4 和 Sox2基因第 7和Scl/Tal1 8的蛋白转导技术。
我们感谢奥利弗Brüstle和干细胞工程技术集团,德国波恩大学,为支持和宝贵的讨论所有成员。我们感谢萨宾申克的SDS – PAGE和持久支持整个项目的准备。妮可拉斯和安娜Magerhans提供优秀的技术支持。此外,我们想感谢安德烈亚斯酒吧和希拉梅尔滕斯影视制作。这项工作得到了来自大众汽车基金会(AZ I/77864)和德国教育与研究部(BMBF第0813号公告),01的赠款。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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TUNER (DE3) pLacI | Novagen | 70625 | ||
Glycerol | Carl Roth | 3783.2 | ||
Na2HPO4 | Roth | T876.1 | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | ||
HCl | Roth | 4625.1 | ||
Imidazol | Roth | X998.4 | ||
NaCl | Roth | 9265.2 | ||
Yeast Extract | Roth | 2363.4 | ||
Trypton/Pepton | Roth | 8952.4 | ||
K2HPO4 | Roth | P749.2 | ||
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | ||
Ampicillin | Sigma | A9518 | ||
Carbenicillin | Sigma | 6344.2 | ||
HEPES | Sigma | H3375 | ||
Lysozyme | Sigma | 62971 | ||
Benzonase | Novagen | |||
L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma | |||
50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | ||
EconoPac columns | Biorad | 732-1010 | ||
Sterile filter 0,22μm | Whatman | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | |||
LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | |||
TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | |||
Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | |||
Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | |||
Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | |||
Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | |||
High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | |||
TrypLE™ Express | Invitrogen | |||
ESGRO (LIF) | Millipore | |||
NEAA | Gibco | 11140035 | ||
L-Glutamin | Gibco | 25030024 | ||
β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | ||
DMEM | Gibco | 11960044 | ||
PBS | Gibco | |||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA | |||
X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
|||
K3(FeIII(CN)6) | Sigma | P-3367 | ||
K4 (FeII(CN)6) | Sigma | P-9387 | ||
MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
X-Gal | Sigma | B4252 |