从小鼠神经组织产生单细胞悬浮液

若要在无菌条件下，它是建议执行层流罩中的所有步骤。 1。材料神经组织解离套件（P）（组件：解决方案1,2，3，4，存储缓冲器） 预分离过滤器 （可选）髓鞘去除珠 β-巯基乙醇 gentleMACS Dissociator 彗星管 MACSmix管肩的HBSS（W / O） 的HBSS（W） 准备开始前的协议以下解决方案： 汉克斯“没有二价阳离子的缓冲盐溶液中的Ca 2 +或Mg 2 +（HBSS（W / O ） HBSS中，标准的，即与Ca 2 +和Mg 2 +（HBSS（W） 根据不同的抗原表位，在随后的应用程序的兴趣，使用的木瓜蛋白酶为基础的神经组织解离套件（P）或胰蛋白酶为基础的神经组织离解包（T）。 从神经组织离解包准备以下解决方案： 解决方案2：添加β-巯基乙醇，以0.067毫米解决方案4：粉末溶于0.7毫升存储缓冲区（试剂盒提供），轻轻混匀（不要旋涡振荡） 酶混合物1：移液器1.9毫升溶液中2到C管和孵育10-15分钟50μL解决方案1（套件），在37 ° C。游离于400毫克的脑组织，这是足够的。 2。游离的神经组织称取脑组织中含有1毫升的HBSS（W / O）管鼠脑转移到C包含1950年μL预热酶混合1的管。 （注：这个协议是书面为≤400毫克，但卷可以扩展的解决方案，以适应脑组织至1600毫克，C管） C管放置到gentleMACS Dissociator和运行方案“m_brain_01”。 旋转（4 RPM使用MACSmix管肩）为15分钟，在37 ° C。 C管放置到gentleMACS Dissociator和运行方案“m_brain_02”。 在解离步骤准备30酶混合，每400毫克组织2液，轻轻混匀20μL的解决方案3和10μL解决方案4。 隔密封帽通过添加酶混合物2到C管和无震荡轻轻混匀。 孵育37℃10分钟旋转管°孵化器中的C。 C管放置到gentleMACS Dissociator和运行方案“m_brain_03”。 孵育37℃10分钟旋转管°孵化器中的C。 短暂离心收集管底部的样品。 3。过滤选择一个过滤器大到足以让感兴趣的细胞通过。例如，浦肯野细胞是太大，通过一个30微米的过滤器，但Prominin – 1 +细胞。 使用suitable1000μL移液器取出细胞，隔密封帽的形式，通过C管，并将其应用到15毫升收集管上的预分离过滤器。 （注：较大的样本量使用50毫升收集管）。 的HBSS（W）10毫升清洗过滤器。 离心机在室温下10分钟在300 XG细胞过滤。 悬浮在您的介质或为随后的应用程序选择的缓冲区上清。 要删除髓鞘碎片，使用髓鞘去除珠。 4。代表性的结果：请参见图1-3 图。 1 gentleMACS Dissociator大脑解离，导致97％的活细胞，流式细胞仪分析显示。 图。 2光镜下神经球形成后7天种植MACS磁性细胞分选后的图片使用反Prominin – 1微珠® NeuroMedium MACS补充B27的PLUS的补充。 CD1小鼠大脑中的神经组织解离套件（P）（P3），准备从细胞。 图。 3髓鞘碎片单细胞悬液，大大损害细胞的分离，髓鞘去除珠去除髓鞘碎片，提高了效率，细胞分离。互委会使用反Prominin – 1微球的分离，P22鼠脑分离使用的神经组织解离套件（P）。从单细胞悬液，细胞分离，可以直接使用，或提交髓鞘枯竭使用髓鞘去除珠。比较与无髓鞘去除样品的分离，表明与以前的髓鞘去除样品纯度较高。