Ensaio de formação de colônia de ágar macio: um método para testar efeitos de novos compostos na proliferação de células cancerosas

Para começar, tome uma concentração apropriada de agarose derretida em um tubo cônico e adicione uma quantidade desejada de meio de cultura quente a ele. Inverta suavemente para misturar o conteúdo. Adicione esta mistura em cada poço de uma placa de seis poços, e deixe-a solidificar. Esta é a camada inferior. Em seguida, trate as células cancerígenas com o composto de juros e adicione a concentração necessária de agarose.

Agora, despeje esta mistura contendo o número desejado de células por mililitro em cada poço. Esta é uma camada contendo células. Uma vez que o meio se solidificar, incubar a placa a 37 graus Celsius por uma semana. Prepare uma camada alimentador misturando agarose ao meio e suplemente esta mistura com o composto de juros. Adicione suavemente esta camada alimentadora em cada poço, deixe-a solidificar e incubar a placa a 37 graus Celsius.

Repita este procedimento de alimentação semanalmente para repor as células com o meio até que as colônias se formem. Se o composto de juros é um inibidor da tumorigenicidade, ele suprimirá o crescimento das células resultando em poucas colônias nos poços. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de formação de colônia de ágar macio para estudar o efeito dos inibidores do PADI na tumorigenicidade das células cancerígenas de mama.

Inicie este procedimento preparando 3% 2-hidroxitil agarose. Em uma garrafa de vidro limpa e seca de 100 mililitros, adicione 0,9 gramas de 2-hidroxietila agarose seguido por 30 mililitros de água destilada. Micro-ondas a mistura por 15 segundos e gire suavemente. Repita este passo até que o pó de agarose se dissolva completamente. Em seguida, autoclave a solução contendo garrafa por 15 minutos.

Deixe a solução agarose esfriar até a temperatura ambiente antes de usar mais. Pré-aqueça vários cinco mililitros e 10 pipetas mililitros em uma incubadora de 37 graus Celsius para evitar que a agarose se solidifique na pipeta durante o manuseio. Solte parcialmente a tampa da garrafa e micro-ondas a solução de 3% de hidroxietila agarose por 15 segundos. Em seguida, gire suavemente a solução e micro-ondas por mais 15 segundos.

Tenha cuidado ao rodar a solução agarose porque a solução surge quando exposta ao ar e pode transbordar. Se houver gel sólido residual na garrafa, micro-ondas por mais alguns segundos. Mantenha a garrafa contendo a solução agarose em um banho de água de 45 graus Celsius durante os próximos passos para evitar que a solução agarose se solidifique prematuramente.

Em seguida, transfira 12 mililitros de mídia aquecida usando as pipetas pré-aquecidas em um tubo cônico de 50 mililitros estéril. Adicione imediatamente três mililitros da solução de 3% de agarose e inverta suavemente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Em seguida, adicione suavemente dois mililitros desta mistura em cada poço de uma placa de cultura de seis poços sem formar bolhas de ar. Incubar a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por uma hora para permitir que a mistura se solidifique.

Após a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. A camada inferior está agora pronta para uso.

Um aspecto difícil deste procedimento é garantir que todas as células sejam distribuídas igualmente e que o gel de agarose derretido não se solidifique antes da adição a cada poço, para garantir que as células sejam misturadas na mídia antes de adicionar o gel de agarose líquida. Além disso, as pipetas são pré-aquecidas antecipadamente para evitar que as soluções se solidifiquem durante o manuseio.

Para preparar a camada de contenção da célula, primeiro experimente células MCF10DCIS e dilua-as a uma concentração celular de 40.000 células por mililitro. Em seguida, pegue oito mililitros de mídia usando pipetas pré-aquecidas, e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros estéril. Adicione imediatamente dois mililitros de 3% de agarose ao tubo cônico, e inverta suavemente para misturar a agarose com a mídia. Evite formar bolhas.

Em seguida, pegue dois mililitros das células e trate-os com dois micromolar BB-chlor-amidine no DMSO, ou DMSO sozinho como o controle. Após o tratamento, misture as células com uma diluição de 0,6% em uma diluição de um a um para fazer uma concentração final de um micromolar BB-chlor-amidine. Em seguida, pegue um mililitro da mistura de agarose celular e adicione suavemente a camada inferior da placa de cultura de seis poços.

Coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente sobre uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior se solidifique. Após a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius durante uma semana antes de adicionar a camada de alimentação. Comece a preparar a camada de alimentação microwaving a solução de 3% de hidroxietila agarose pré-fabricada como antes, e equilibrando a garrafa de solução de agarose em um banho de água de 45 graus Celsius.

Misture um mililitro de solução de 3% de agarose com nove mililitros de mídia quente em um tubo cônico de 50 mililitros, e inverta suavemente para misturar a agarose com a mídia. Evite formar bolhas de ar. Depois de tratar a mistura com bb-chlor-amidine, adicione suavemente um mililitro da mistura em cada poço da placa de cultura de seis poços contendo as camadas inferior e macia. Em seguida, coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente sobre uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura se solidifique.

Após a solidificadora da camada alimentadora, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius. Repita este procedimento alimentar semanalmente sobrepondo um mililitro de 0,3% da solução de tratamento médio agarose na camada alimentadora existente para repor as células com novas mídias até que a formação da colônia seja observada.