Подготовка мышей к модели тяжелого острого панкреатита с помощью комбинации церулеина и липополисахарида внутрибрюшинной инъекции
Summary
Внутрибрюшинное введение препарата является безопасным и эффективным неинвазивным подходом для индуцирования повреждения поджелудочной железы. В этом исследовании сравнивались пять различных протоколов внутрибрюшинных инъекций на мышах для индуцирования различной степени повреждения поджелудочной железы и была создана модель тяжелого повреждения поджелудочной железы для изучения патологических изменений и стратегий лечения тяжелого острого панкреатита (САП).
Abstract
Лечение тяжелого острого панкреатита (САП) с высокими показателями смертности представляет собой значительную клиническую проблему. Изучение патологических изменений, связанных с САП, с использованием животных моделей может помочь в определении потенциальных терапевтических мишеней и изучении новых подходов к лечению. Предыдущие исследования в первую очередь индуцировали повреждение поджелудочной железы путем инъекции тавиаурохолата натрия в ретроградный желчный проток, но влияние хирургического повреждения на качество животной модели остается неясным. В этом исследовании мы использовали различную частоту внутрибрюшинных инъекций церулеина в сочетании с различными дозами ЛПС для индуцирования повреждения поджелудочной железы у мышей C57BL/6J и сравнили степень повреждения по пяти протоколам внутрибрюшинных инъекций. Что касается индуцирования острого панкреатита у мышей, предлагается протокол внутрибрюшинной инъекции, который приводит к смертности до 80% в течение 5 дней. В частности, мыши получали десять ежедневных внутрибрюшинных инъекций церулеина (50 мкг/кг), за которыми следовала инъекция ЛПС (15 мг/кг) через час после последнего введения церулина. Регулируя частоту и дозировку вводимых лекарств, можно эффективно манипулировать тяжестью повреждения поджелудочной железы. Эта модель демонстрирует высокую управляемость и имеет короткий цикл репликации, что делает ее возможной для выполнения одним исследователем без необходимости использования дорогостоящего оборудования. Он удобно и точно моделирует ключевые характеристики заболевания, наблюдаемые в SAP человека, демонстрируя при этом высокую степень воспроизводимости.
Introduction
Тяжелый острый панкреатит характеризуется быстрым началом, быстрым прогрессированием и высокими показателями смертности в области заболевания пищеварительной системы1. Высокий уровень смертности всегда был в центре внимания клинических исследований. Из-за непредсказуемых изменений клинических условий, гетерогенности проявлений болезни и ограниченной доступности образцов для человека, создание животных моделей становится все более важным для исследований болезней.
Ретроградная инъекция таурохолата натрия в общий желчный проток обычно используется для создания модели SAP2 на крысе. Моделируя обструкцию поджелудочной железы и индуцируя рефлюкс желчи и жидкости поджелудочной железы, этот метод моделирования демонстрирует высокий процент успеха при воспроизведении животных моделей SAP. Тем не менее, следует отметить, что инвазивная хирургия оказывает влияние на саму животную модель. Кроме того, этот метод ограничен более крупными животными, такими как крысы и собаки, которые в основном используются в качестве подопытных. В целях моделирования часто используются альтернативные методы, включая дуоденальную интубацию3, прямую пункцию двенадцатиперстной кишки4 и прямую пункцию желчного протока-протока поджелудочной железы5.
Внутрибрюшинные инъекции и методы диетического моделирования дают неинвазивные преимущества, которые могут быть применены к животным любого размера. Мышиная модель САП, индуцированная кормлением холин-дефицитным этионином (CDE)6, имеет определенные осложнения, такие как плохо контролируемая гипергликемия и гипокальциемия, что делает ее непригодной для оценки новых диагностических и терапевтических подходов. С другой стороны, внутрибрюшинное введение церулеина в сочетании с L-аргинином7 представляет собой наиболее часто используемый метод индуцирования острого панкреатита у мышей. В частности, повторное внутрибрюшинное введение Caerulein — аналога холецистокинина — обеспечивает весьма подходящий подход к исследованию различных аспектов, связанных с этим деструктивным заболеванием, включая патогенез, воспаление и процессы регенерации. Благодаря своему структурному сходству с холецистокинином (ЦКК), церулин эффективно стимулирует сокращение желчного пузыря и секрецию ферментов поджелудочной железы, что приводит к дисбалансу секреции ферментов с последующим саморазрушением8. Липополисахарид (ЛПС), будучи повсеместно распространенным и широко изученным как молекула молекулы, ассоциированной с патогенами, может быть объединен с церулеином путем внутрибрюшинной инъекции для создания эффективной модели САП у мышей. Эта комбинация быстро запускает и высвобождает значительное количество воспалительных цитокинов, что приводит к чрезмерному местному и системному воспалению. В нескольких исследованиях сообщалось об индукции моделей SAP у мышей путем внутрибрюшинного введения церулеина в сочетании с ЛПС. Это может быть связано с тем, что внутрибрюшинное введение церулеина может вызвать отек поджелудочной железы и кровоизлияние у мышей, в то время как добавление ЛПС может немедленно вызвать панкреонекроз и усугубить системную воспалительную реакцию, сепсис и даже органную недостаточность. В настоящее время существуют различия в дозировке и частоте внутрибрюшинных инъекций церулеина, а также непоследовательность в дополнительной дозировке ЛПС. Достижение согласованности в моделях SAP мыши является сложной задачей 9,10,11,12; Поэтому необходимо установить стандартизированный протокол для получения идеальной модели. В данной статье мы опишем протокол внутрибрюшинного введения мышам и исследуем оптимальную частоту инъекций и дополнительную дозировку ЛПС.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время не хватает эффективных средств для снижения высокой смертности у пациентов с тяжелым острым панкреатитом. Крайне важно исследовать эффективность лекарственных препаратов в усилении механизмов иммунной стабильности. Существует острая потребность в идеальной живот?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Исследовательскими проектами в области здравоохранения и медицинских наук в городе Хуайнань (No. HNWJ2023005); Муниципальная программа руководства научно-техническим планом в городе Хуайнань (No 2023151); Программа обучения инновациям и предпринимательству студентов колледжа провинции Аньхой (No S202310361254); Девятая партия программы «50· Звезды науки и техники» в городе Хуайнань и проекте строительства ключевых клинических специальностей провинции Аньхой. Выражаем благодарность лабораторному отделению Первого филиала больницы Аньхойского университета науки и технологий за предоставление соответствующих данных испытаний.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
References
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777 (2022).
- Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
- Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
- Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
- Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
- Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685 (2017).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 1192-1204 (1985).
- Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754 (2019).
- Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470 (2022).
- Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928 (2021).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
- Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
- Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585 (2021).
- Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
- Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363 (2023).
- Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455 (2023).
- Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
- Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
- Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
- Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).
.