Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması
Summary
İntraperitoneal ilaç uygulaması, pankreas hasarını indüklemek için güvenli ve etkili bir non-invaziv yaklaşımdır. Bu çalışma, değişen derecelerde pankreas hasarını indüklemek için fareler üzerinde beş farklı intraperitoneal enjeksiyon protokolünü karşılaştırdı ve şiddetli akut pankreatit (SAP) için patolojik değişiklikleri ve tedavi stratejilerini araştırmak için bir ciddi pankreas hasarı modeli oluşturdu.
Abstract
Yüksek mortalite oranlarına sahip şiddetli akut pankreatitin (SAP) tedavisi önemli bir klinik zorluk teşkil etmektedir. Hayvan modelleri kullanılarak SAP ile ilişkili patolojik değişikliklerin araştırılması, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine ve yeni tedavi yaklaşımlarının araştırılmasına yardımcı olabilir. Önceki çalışmalar öncelikle sodyum taviaurokolatın retrograd safra kanalı enjeksiyonu yoluyla pankreas hasarına neden olmuştur, ancak cerrahi hasarın hayvan modelinin kalitesi üzerindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmada, C57BL / 6J farelerinde pankreas hasarını indüklemek için farklı dozlarda LPS ile birlikte çeşitli intraperitoneal Caerulein enjeksiyonları kullandık ve beş intraperitoneal enjeksiyon protokolünde yaralanma derecesini karşılaştırdık. Farelerde akut pankreatitin indüklenmesi ile ilgili olarak, 5 gün içinde% 80 gibi yüksek bir mortalite oranıyla sonuçlanan bir intraperitoneal enjeksiyon protokolü önerilmektedir. Spesifik olarak, farelere on günlük intraperitoneal Caerulein enjeksiyonu (50 μg / kg) verildi, ardından son Caerulein uygulamasından bir saat sonra bir LPS (15 mg / kg) enjeksiyonu yapıldı. Enjekte edilen ilaçların sıklığını ve dozajını ayarlayarak, pankreas hasarının ciddiyetini etkili bir şekilde manipüle edebilirsiniz. Bu model, güçlü kontrol edilebilirlik sergiler ve kısa bir çoğaltma döngüsüne sahiptir, bu da pahalı ekipman gerektirmeden tek bir araştırmacı tarafından tamamlanmasını mümkün kılar. İnsan SAP’sinde gözlemlenen temel hastalık özelliklerini uygun ve doğru bir şekilde simüle ederken, yüksek derecede tekrarlanabilirlik gösterir.
Introduction
Şiddetli akut pankreatit, sindirim sistemi hastalığı alanında hızlı başlangıç, hızlı ilerleme ve yüksek mortalite oranları ile karakterizedir1. Yüksek ölüm oranı her zaman klinik araştırmaların önemli bir odak noktası olmuştur. Klinik koşullardaki öngörülemeyen değişiklikler, hastalık belirtilerinin heterojenliği ve insan örneklerinin sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, hayvan modellerinin oluşturulması hastalık araştırmaları için giderek daha önemli hale gelmiştir.
Sodyum taurokolatın ortak safra kanalına retrograd enjeksiyonu, SAP2’nin bir sıçan modelini oluşturmak için yaygın olarak kullanılır. Pankreatikobiliyer obstrüksiyonu simüle ederek ve safra ve pankreas sıvısının reflüsünü indükleyerek, bu modelleme tekniği SAP hayvan modellerinin çoğaltılmasında yüksek bir başarı oranı sergiler. Bununla birlikte, invaziv cerrahinin hayvan modelinin kendisi üzerinde bir etkisi olduğu unutulmamalıdır. Ayrıca, bu yöntem, öncelikle deney denekleri olarak kullanılan fareler ve köpekler gibi daha büyük hayvanlarla sınırlıdır. Duodenal entübasyon3, direkt duodenal ponksiyon4 ve safra kanalı-pankreas kanalının5 direkt delinmesi gibi alternatif teknikler modelleme amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır.
İntraperitoneal enjeksiyon ve diyet modelleme yöntemleri, her büyüklükteki hayvana uygulanabilen non-invaziv avantajlar sunar. Kolin eksikliği olan etiyonin (CDE)6 ile beslenen SAP’nin fare modeli, kötü kontrol edilebilen hiperglisemi ve hipokalsemi gibi bazı komplikasyonlar sunar ve bu da onu yeni tanı ve tedavi yaklaşımlarını değerlendirmek için uygun hale getirmez. Öte yandan, L-arginin7 ile kombine edilen Caerulein’in intraperitoneal enjeksiyonu, farelerde akut pankreatiti indüklemek için en yaygın kullanılan yöntemi temsil eder. Spesifik olarak, bir kolesistokinin analoğu olan Caerulein’in tekrarlanan intraperitoneal uygulaması, patogenez, inflamasyon ve rejenerasyon süreçleri dahil olmak üzere bu yıkıcı hastalıkla ilgili çeşitli yönleri araştırmak için oldukça uygun bir yaklaşım sağlar. Kolesistokinin (CCK) ile yapısal benzerliği nedeniyle, Caerulein safra kesesi kasılmasını ve pankreas enzim salgılanmasını etkili bir şekilde uyarır, bu da enzim salgılanmasında bir dengesizliğe ve ardından kendi kendini yok etmeye yol açar8. Lipopolisakkarit (LPS), her yerde bulunan ve patojenle ilişkili bir moleküler model molekülü olarak kapsamlı bir şekilde incelenen, etkili bir SAP fare modeli oluşturmak için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla Caerulein ile birleştirilebilir. Bu kombinasyon, önemli sayıda inflamatuar sitokini hızla tetikler ve serbest bırakır, bu da aşırı lokal ve sistemik inflamasyona neden olur. Birkaç çalışma, LPS ile kombine edilmiş Caerulein’in intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla farelerde SAP modellerinin indüksiyonunu bildirmiştir. Bu, Caerulein’in intraperitoneal enjeksiyonunun farelerde pankreas ödemi ve kanamaya neden olabileceği gerçeğine bağlanabilirken, LPS ilavesi hemen pankreas nekrozunu indükleyebilir ve sistemik inflamatuar yanıtı, sepsisi ve hatta organ yetmezliğini şiddetlendirebilir. Şu anda, intraperitoneal Caerulein enjeksiyonlarının dozajında ve sıklığında farklılıklar ve ek LPS dozajında tutarsızlık vardır. Fare SAP modellerinde tutarlılık elde etmek zordur 9,10,11,12; Bu nedenle, ideal bir model elde etmek için standart bir protokol oluşturmak gerekir. Bu yazıda, farelerde intraperitoneal enjeksiyon için bir protokol açıklıyoruz ve optimal enjeksiyon sıklığını ve ek LPS dozunu araştırıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda, şiddetli akut pankreatitli hastalarda yüksek mortalite oranını iyileştirmek için etkili bir araç eksikliği vardır. İmmün stabilite mekanizmalarını arttırmada ilaçların etkinliğinin araştırılması çok önemlidir. Şiddetli akut pankreatit için ideal bir hayvan modeline acil ihtiyaç vardır. C57BL / 6J genetik geçmişine sahip fareler, SAP patofizyolojisi çalışmaları da dahil olmak üzere biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. B6J farelerinde 70 yılı aşkın …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Huainan Şehrindeki Sağlık ve Tıp Bilimi Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir (No. HNWJ2023005); Huainan Şehrinde Belediye Rehberlik Bilim ve Teknoloji Planı Programı (No.2023151); Anhui İl Koleji Öğrencilerinin İnovasyon ve Girişimcilik Eğitim Programı (No. S202310361254); dokuzuncu parti “50· Bilim ve Teknoloji Yıldızları “Huainan Şehri ve Anhui İli Anahtar Klinik Özel İnşaat Projesi’ndeki inovasyon ekipleri. Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Laboratuvar Bölümüne, ilgili test verilerini sağladıkları için şükranlarımızı sunarız.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
References
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777 (2022).
- Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
- Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
- Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
- Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
- Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685 (2017).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 1192-1204 (1985).
- Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754 (2019).
- Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470 (2022).
- Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928 (2021).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
- Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
- Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585 (2021).
- Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
- Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363 (2023).
- Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455 (2023).
- Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
- Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
- Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
- Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).
.