Una procedura semplificata e standardizzata per la generazione di vettori virali adeno-associati ad alto titolo e di alta qualità utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare

I dettagli dei reagenti, dei plasmidi e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La composizione dei buffer utilizzati è fornita nel File supplementare 1. 1. Preparazione del plasmide Plasmidi trasformabili (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) in E. coli.NOTA: Qualsiasi ceppo di E.coli può essere utilizzato per l’amplificazione plasmidica. Per alcuni plasmidi, speciali cellule competenti come NEB stable possono migliorare la resa plasmidica. I tre plasmidi utilizzati in questo protocollo sono pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 e pAAV-Cap: pAAV-RC6. Far crescere i batteri in terreni LB contenenti gli antibiotici selettivi appropriati in volume ottimale a 37 °C per 16-18 ore.NOTA: Quando si utilizzano cellule stabili NEB, coltura a 30 °C per 18-20 ore. Raccogliere il DNA plasmidico centrifugando l’E. coli. terreno di coltura a 4000 x g, 4 °C, per 15 min. Versare con cura il liquido surnatante dal flacone della centrifuga in un contenitore di scarto e purificare il DNA plasmidico dal pellet con un kit di purificazione plasmidico privo di endotossine su larga scala.NOTA: Assicurati di versarlo lentamente ed evitare schizzi. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro.NOTA: Controllare la purezza del DNA controllando il rapporto OD260/OD280 . Il rapporto per il DNA puro è di circa 1,8. La concentrazione di DNA deve essere superiore a 1 μg/μL per la successiva fase di co-trasfezione. Preparare scorte di glicerolo batterico aggiungendo 500 μl di coltura notturna a 500 μl di glicerolo al 50% in un crioviale e conservare a -80 °C. 2. Preparazione HEK293T celle Seminare HEK293T cellule con DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di FBS in una fabbrica di cellule a 10 strati (CF10) e lasciare che le cellule crescano nell’incubatore durante la notte.NOTA: I passaggi delle celle 293T devono essere inferiori a 10 per avere le condizioni ottimali per una robusta produzione di AAV. Se possibile, non aggiungere antibiotici ai terreni di coltura in questo momento. Il CF10 ha una superficie di crescita circa 42 volte superiore a quella di una piastra di coltura cellulare da 150 mm. Seminare la stessa densità cellulare in una piastra di coltura cellulare da 150 mm per consentire di controllare la crescita cellulare al microscopio. Preparare una sospensione cellulare da 1075 mL, aggiungere 25 mL di sospensione cellulare a un piatto da 150 mm e aggiungere il resto al CF10. Controllare la confluenza cellulare il giorno successivo prima della trasfezione.NOTA: Le cellule dovrebbero raggiungere l’80%-90% di confluenza al momento della trasfezione osservando al microscopio. 3. Tripla trasfezione di plasmidi AAV Calcolare la quantità di ciascun plasmide necessaria (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-sierotipo) per avere un rapporto molare 1,2: 1: 1 con 2,5-5 mg di DNA totale per CF10.NOTA: Il rapporto molare dei tre plasmidi potrebbe essere variabile per un’efficacia di trasfezione ottimale. È meglio testarlo in un ambiente su piccola scala prima di passare a questo settaggio CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 e pAAV-RC6 vengono utilizzati per produrre il virus AAV6-CMV-GFP come esempio. La formula del calcolatore PEI è elencata nella Tabella 1. Aliquotare 350 mL di OptiMEM in un flacone sterile da 500 mL. Aggiungere tutti e tre i DNA plasmidici nel flacone contenente l’Opti-MEM. Mescola bene. Aggiungere 15 mL di soluzione di polietilenimmina (PEI) da 1 mg/mL (rapporto 1:3 μg di DNA per μg di PEI). Agitare energicamente la miscela OptiMEM/DNA/PEI su e giù per 30 s.NOTA: Va bene fare le bolle. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10-15 minuti.NOTA: Un’incubazione più lunga può ridurre l’efficienza della trasfezione. Aggiungere la soluzione OptiMEM/DNA/PEI al flacone da 1 L contenente 700 ml di DMEM a basso contenuto di glucosio con 10 mM di HEPES e 2% di FBS. Mescola bene.NOTA: In questo studio, il basso glucosio nel DMEM ha mostrato una migliore produzione del vettore AAV dopo la co-trasfezione. L’aggiunta di HEPES aiuta a mantenere le cellule in condizioni migliori. Mescolare ruotando lentamente la bottiglia. Evita di creare troppe bolle. Estrarre il CF10 dall’incubatrice e aspirare il terreno in un contenitore per rifiuti.NOTA: Appoggiare il CF10 sulla superficie all’interno della cappa e sollevare gradualmente un lato verso l’alto, aspirare lentamente il supporto senza staccare le celle. Aggiungere con cautela la miscela di trasfettante al CF10. Assicurarsi che tutti e dieci gli strati siano coperti da un supporto.NOTA: Aggiungere 25 ml di miscela di trasfettante nel piatto da 150 mm. Monitorare le cellule quotidianamente fino al raccolto. Aggiungere la miscela di trasfettante rimanente nel CF10 versando lentamente. Ruotare il CF10 con molta attenzione e garantire un volume uguale per ogni strato. Rimettere il CF10 nell’incubatrice per 72-96 ore.NOTA: Controllare la parabola del monitor da 150 mm per decidere quando raccogliere i vettori AAV. Quando le cellule si staccano molto facilmente con un carico completo di AAV, è il momento di raccogliere. 4. Raccolta di vettori AAV Raccogliere il virus 3-4 giorni dopo la trasfezione agitando energicamente il CF10. Versare il terreno nelle provette coniche da 250 ml e centrifugare il virus a 4000 x g per 20 minuti a 4 °C.NOTA: Per il sierotipo AAV6 utilizzato in questo protocollo, l’80% di AAV rimarrà per lo più legato al materiale cellulare nel pellet. E il 20% di AAV è stato secreto nei media. Queste proporzioni possono differire per altri sierotipi di AAV. Filtrare il surnatante chiarificato con un’unità filtrante da 0,45 μm e conservarlo per le precipitazioni. Sciacquare il CF10 con 500 mL di tampone DPBS 1x e centrifugare a 4000 x g per 20 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto e una pipetta di aspirazione. Aggiungere 20 mL di tampone di lisi AAV per CF10 a -80 °C fino alla purificazione.NOTA: Trasferire il lisato di AAV in una provetta conica da 50 mL per la successiva estrazione di AAV. Estrarre il surnatante filtrato, aggiungere una soluzione di NaCl al 40% di PEG-2,5 M per una concentrazione finale dell’8% di PEG e incubare in una cella frigorifera su un rotatore orbitale per almeno 3 ore o durante la notte.NOTA: Per 100 mL di surnatante, aggiungere 25 mL di soluzione di NaCl PEG-2,5 M al 40%. Far precipitare il virus centrifugando a 4000 x g per 30 minuti a 4 °C.NOTA: Trasferire la miscela in provette coniche da 250 ml per la centrifugazione. Aspirare per rimuovere il surnatante e aggiungere 5-10 ml di tampone di risospensione AAV HEPES per sospendere i pellet. Trasferire in una provetta conica da 50 mL per continuare la purificazione a valle, oppure conservarla a -80 °C. 5. Estrazione AAV Scongelare il pellet di virus in un bagno d’acqua a 37 °C per 10-15 minuti con uno shaker.NOTA: Agitare il lisato AAV per scioglierlo completamente. Congelare in bagno di etanolo al 100% a -80 °C per 20-30 min.NOTA: In alternativa, il ciclo di congelamento può essere eseguito con un becher freddo di etanolo al 100% circondato da ghiaccio secco. Eseguire il congelamento/scongelamento 3-4 volte e, se necessario, un vortice intermedio.NOTA: Questo ciclo può essere messo in pausa nella fase di congelamento. Conservare il lisato AAV a -80 °C fino al lavoro a valle. Scongelare il lisato di AAV (dal punto 5.3) e l’AAV risospeso (dal punto 4.7)” in un bagno d’acqua a 37 °C per 10-15 minuti con un agitatore e un vortice.NOTA: Assicurati che si sciolga completamente e mescolalo. Aggiungere la nucleasi benzasi (250 unità/μL) al lisato di AAV e l’AAV risospeso per una concentrazione finale di 50 unità/mL. Vortex la soluzione. Incubare a bagnomaria a 37 °C agitando per 30 minuti.NOTA: Estrarre le aliquote di desossicolato di sodio al 10% a bagnomaria per consentire lo scioglimento, il riscaldamento e la miscelazione accurata. Aggiungere il 10% di desossicolato di sodio per una concentrazione finale dello 0,5% e incubare a 37 °C con agitatore acceso per 30 minuti.NOTA: Il desossicolato di sodio è stato utilizzato per migliorare il rilascio di AAV dalle cellule. Distribuire la soluzione grezza di AAV in provette da centrifuga da 2 mL e centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una provetta conica da 50 mL.NOTA: Utilizzare una pipetta da 1 ml per trasferire il surnatante. Scartare i pellet. Aggiungere una quantità uguale di cloroformio ed estrarre AAV agitando per 1-2 minuti.NOTA: La soluzione deve diventare opaca, bianca, simile al latte. Trasferire la soluzione lattiginosa in provette da centrifuga da 2 ml e distribuirla uniformemente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 min a 4 °C. Pipettare con cura lo strato rosa superiore e trasferirlo in una nuova provetta conica da 50 mL.NOTA: Non disturbare gli strati di cloroformio/proteine. Misurare il volume finale utilizzando una pipetta. Secondo la tabella dei volumi grezzi di AAV-PEG-Solfato (Tabella 2), miscelare volumi appropriati di soluzione di SO4 al 50% (NH4)2e PEG al 40%. Vortice per 2 min. Trasferire la miscela in provette da centrifuga da 2 ml per distribuirla uniformemente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 min a 4 °C Raccogliere lo strato inferiore utilizzando un ago da 22 G e una siringa da 3 mL. Raccogliere l’AAV in una provetta conica da 50 mL e conservarla a 4 °C per la successiva ultracentrifugazione con gradienti di iodixanolo. 6. Purificazione di AAV mediante ultracentrifugazione con gradiente di iodixanolo Preparare i gradienti di iodixanolo prima di caricare l’AAV in base al numero di provette per ultracentrifugazione utilizzate (Tabella 3).NOTA: Il rosso fenolo è stato utilizzato per osservare gli strati. Sovrapporre lentamente ciascuna soluzione in una provetta per ultracentrifuga in polipropilene a chiusura rapida con una siringa da 10 ml collegata con un ago lungo puntato da 16 G. Evita le bolle. Aggiungere con cautela fino a 17 ml di soluzione di AAV sopra il gradiente con una siringa da 22 G. Utilizzare il tampone per dialisi AAV per rabboccare il tubo.NOTA: Aggiungere la soluzione AAV caricando le gocce contro la parete nella provetta dell’ultracentrifuga. Non disturbare i livelli di sfumatura. Sigillare le provette dell’ultracentrifuga con un sigillante elettrico.NOTA: Bilanciare le provette prima di inviarle all’ultracentrifuga con una differenza di ±0,2 g. Centrifugare a 350.000 x g per 2 ore in un rotore Ti70 a 4 °C. Rimuovere con cautela le provette dal rotore e posizionarle nel rack delle provette per ultracentrifuga.NOTA: Assicurarsi che le pendenze non vengano disturbate. Raccogli le frazioni AAV seguendo i passaggi seguenti:Stabilizzare il tubo su un supporto per supporto. Forare le provette dell’ultracentrifuga leggermente al di sotto dell’interfaccia 40%-60% con un ago da 19 G collegato a una siringa da 10 mL.NOTA: L’apertura dell’ago deve essere rivolta verso l’alto, rivolta verso la pendenza del 40%. Praticare un foro nella parte superiore del tubo con un ago da 16 G. Raccogliere fino a 5 mL per provetta. Evitare di raccogliere la contaminazione proteica all’interfaccia 25%-40%. Ripetere l’operazione per ogni provetta per ultracentrifuga.NOTA: Trasferire le frazioni AAV in una provetta conica da 50 mL. 7. Secondo ciclo di ultracentrifugazione con gradienti di iodixanolo NOTA: Questo passaggio è facoltativo. Questo passaggio consiste nel ridurre il rapporto AAV vuoto per un capside AAV completo di qualità superiore. Diluire AAV >1:1 con tampone per dialisi AAV.NOTA: L’AAV raccolto dal primo ciclo di ultracentrifugazione era al 40% di strato di iodixanolo. Dovrebbe essere diluito di almeno il 50% per poter essere caricato sopra lo strato di iodixanolo al 30%. Sovrapporre ciascuna soluzione (Tabella 4) in una provetta per ultracentrifugazione utilizzando un ago puntato da 16 G e collegare lentamente una siringa da 10 mL. Evita le bolle. Aggiungere con cautela 20 ml di soluzione diluita di AAV sopra il gradiente con una siringa da 22 G. Utilizzare il tampone per dialisi AAV per rabboccare il tubo. Ripetere i passaggi da 6.4 a 6.7. 8. Dialisi e concentrazione AAV Trasferire il virus AAV nella cassetta per dialisi utilizzando un nuovo ago da 18 G e una siringa da 10 mL. Iniettare lentamente il virus nella cassetta e rimuovere l’aria da essa. Aggiungere una barra di agitazione al becher contenente il tampone per dialisi AAV e posizionarlo su una piastra di agitazione. Inserire la cassetta per dialisi nel tampone per dialisi con una boa galleggiante. Mescolare a 4 °C. Cambiare 2-3 volte il tampone per dialisi AAV.NOTA: Utilizzare una quantità di buffer sufficiente per consentire alla cassetta di galleggiare ed eseguire la sostituzione del buffer. Coprire il bicchiere con un foglio di alluminio. Utilizzando una siringa da 10 ml collegata con un ago da 18 G, raccogliere il virus dalla cassetta in un’unità di filtro centrifuga. Centrifugare a 4.000 x g per 15-30 min a 4 °C.NOTA: Inserire l’AAV con il tampone per dialisi AAV 2-3 volte. Concentrare l’AAV fino a quando ~200 μL di rimanenza si trovano sopra il filtro. Raccogliere l’AAV concentrato dall’unità filtrante. Sciacquare il filtro con altri 300 μl di tampone per dialisi AAV e trasferirlo nell’AAV concentrato. Filtrare il virus attraverso una siringa da 0,22 μm utilizzando una siringa a slittamento luer da 1 mL di tubercolina. Per garantire la minima perdita di volume, utilizzare la siringa da 10 ml per spingere l’aria attraverso il filtro 2-3 volte. Conservare temporaneamente il virus AAV purificato a 4 °C per la titolazione.NOTA: Titolare il virus, aliquotare e conservare a -80 °C entro 1 settimana. 9. Titolazione del virus AAV NOTA: La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) TaqMan è stata utilizzata per titolare l’AAV purificato. Trattare i vettori AAV con DNasi I e incubare a 37 °C per 30 minuti, quindi incubare a 95 °C per 10 minuti.NOTA: Come esempio di reazione da 10 μL, vengono utilizzati 2 μL di campione di virus AAV, 1 μL di DNasi, 1 μL di tampone DNasi e 6 μL di H2O. Può essere eseguito in un termociclatore con provette per PCR. Preparare i set di primer mirati alla regione di inserimento AAV.NOTA: I bersagli potrebbero essere il promotore, il transgene e il reporter nel costrutto AAV. Gli inneschi sono elencati nella Tabella 5. Preparare gli standard dei plasmidi del DNA (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 e 0,0001 pg/μL) e un controllo negativo (H2O). Preparare la master mix qPCR, compresi i primer, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare gli standard e i campioni in triplicato su una piastra PCR. Aggiungere la miscela qPCR agli standard e ai campioni. Sigillare la piastra ed eseguire la reazione qPCR secondo le istruzioni del produttore.NOTA: Le condizioni di reazione dipendono dai materiali/reagenti e dallo strumento. Sono applicabili cicli di PCR rapidi e convenzionali. Calcola il titolo del virus AAV.NOTA: La concentrazione del campione in questo protocollo è di 1/10 di diluizione rispetto ai campioni originali. Aliquotare il virus AAV in provette da 1,5 mL e conservare a 4 °C per un massimo di un mese e conservare a -80 °C a lungo termine.NOTA: Evitare cicli di congelamento/scongelamento per la conservazione. Se utilizzato per esperimenti in vivo , non utilizzare scongelare oltre due aliquote. 10. Controllo di qualità di AAV NOTA: I virus AAV sono stati caratterizzati per la purezza mediante colorazione d’argento SDS-PAGE utilizzando un gel SDS-PAGE e colorati utilizzando un kit di colorazione disponibile in commercio. Denaturare 3 x 109 vg di campione di virus AAV con tampone Laemmli.NOTA: Utilizzare un virus AAV di riferimento come controllo. Viene utilizzato il capside completo di riferimento AAV6-CMV-GFP. Caricare l’AAV denaturato su un gel SDS-PAGE con gradiente 4%-20% e farlo funzionare a 180 V per 50 minuti. Rimuovere il gel dalla piastra per elettroforesi. Colorare il gel con un kit per la colorazione dell’argento secondo le istruzioni del produttore. Controllare le proteine del capside AAV VP1, VP2 e VP3.NOTA: Il virus AAV puro contiene solo la proteina del capside VP1, VP2 e VP3. Se non puro, altre bande proteiche sarebbero visibili sul gel.NOTA: La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di virioni AAV ricombinanti colorati negativamente è stata eseguita per valutare l’integrità morfologica e il rapporto pieno/vuoto. Raccogli una griglia EM con una pinzetta e siediti sulla panca con il lato lucido della griglia rivolto verso l’alto. Pipettare 5 μL di campione AAV sulla griglia e lasciarlo asciugare per evaporazione.NOTA: Diluire l’AAV se necessario. 1012 vg/mL è un titolo medio. Potrebbero essere necessari 30-60 minuti per asciugare la griglia. Lavare la griglia pipettandola, goccia a goccia, con circa 200 μL di H2O sulla griglia. Rimuovere l’acqua in eccesso posizionando lentamente una carta per cromatografia verticalmente accanto alla griglia. Pipet 5 μL di soluzione di acetato di uranile al 2% sulla griglia. Incubare per 5 minuti e rimuovere con lo stoppino come menzionato sopra. Lasciare asciugare la griglia. Visualizza le particelle AAV sotto un microscopio elettronico a trasmissione (con un ingrandimento di 50.000 volte). I capsidi virali con un genoma virale appariranno come esagoni bianchi omogenei, mentre i capsidi vuoti appariranno come esagoni con un bordo bianco ma un centro scuro. Conta casualmente almeno 100 particelle per determinare la percentuale approssimativa di pieno vs. particelle AAV vuote.