Basisopname: een techniek voor het analyseren van reacties van smaakneuronen in Drosophila
Summary
Een zelden gebruikte methode van elektrofysiologische registratie, basisregistratie, maakt analyse mogelijk van kenmerken van smaakcodering die niet kunnen worden onderzocht met conventionele registratiemethoden. Basisregistratie maakt ook de analyse mogelijk van smaakreacties op hydrofobe stimuli die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van traditionele elektrofysiologische methoden.
Abstract
Insecten proeven de buitenwereld via smaakharen, of sensilla, die poriën aan hun uiteinden hebben. Wanneer een sensillum in contact komt met een potentiële voedselbron, komen verbindingen van de voedselbron via de porie binnen en activeren ze neuronen binnenin. Al meer dan 50 jaar worden deze reacties geregistreerd met behulp van een techniek die tipregistratie wordt genoemd. Deze methode heeft echter grote beperkingen, waaronder het onvermogen om neurale activiteit voor of na stimuluscontact te meten en de vereiste dat tastanten oplosbaar zijn in waterige oplossingen. We beschrijven hier een techniek die we base recording noemen, die deze beperkingen overwint. Basisregistratie maakt het mogelijk om de activiteit van smaakneuronen voor, tijdens en na de stimulus te meten. Het maakt dus een uitgebreide analyse mogelijk van UIT-reacties die optreden na een smaakstimulus. Het kan worden gebruikt om hydrofobe verbindingen te bestuderen, zoals feromonen met een lange keten die een zeer lage oplosbaarheid in water hebben. Samenvattend biedt basisregistratie de voordelen van single-sensillum elektrofysiologie als middel om neuronale activiteit te meten – hoge ruimtelijke en temporele resolutie, zonder de noodzaak van genetische hulpmiddelen – en overwint het de belangrijkste beperkingen van de traditionele tipregistratietechniek.
Introduction
Insecten, waaronder drosofifielvliegen, zijn begiftigd met een geavanceerd smaaksysteem waarmee ze complexe chemische informatie uit hun omgeving kunnen halen. Dit systeem stelt hen in staat om de chemische samenstelling van verschillende stoffen te onderscheiden en onderscheid te maken tussen voedzame stoffen en schadelijke 1,2.
De kern van dit systeem wordt gevormd door gespecialiseerde structuren die bekend staan als smaakharen of sensilla, strategisch geplaatst op verschillende lichaamsdelen. Bij drosofielvliegen bevinden deze sensilla zich op het labellum, het belangrijkste smaakorgaan van de vliegenkop 1,2,3,4, evenals op de poten en vleugels 1,2,5,6. Het labellum bevindt zich aan het uiteinde van de proboscis en bevat twee lobben 4,7,8. Elke lob is bedekt met 31 smaakgevoeligen, gecategoriseerd als kort, lang en gemiddeld 4,7,8. Deze sensilla bevatten elk 2-4 smaakneuronen 1,2,9,10. Deze smaakneuronen brengen leden van ten minste vier verschillende genfamilies tot expressie, namelijk de genen Gustatorium receptor (Gr), Ionotrope receptor (Ir), Pickpocket (Ppk) en Transient receptor potential (Trp) 1,2,11,12,13. Deze diversiteit aan receptoren en kanalen stelt insecten in staat om een breed scala aan chemische verbindingen te herkennen, waaronder zowel niet-vluchtige als vluchtige signalen 1,2,14.
Al meer dan 50 jaar hebben wetenschappers de respons van smaakneuronen en hun receptoren gekwantificeerd met behulp van een techniek die tipregistratiewordt genoemd 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Deze methode heeft echter grote beperkingen. Ten eerste kan neurale activiteit alleen worden gemeten tijdens contact met de stimulus, en niet voor of na contact. Deze beperking sluit het meten van spontane spiking-activiteit uit en voorkomt het meten van OFF-reacties. Ten tweede kunnen alleen smaakstoffen worden getest die oplosbaar zijn in waterige oplossingen.
Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door een zelden gebruikte alternatieve elektrofysiologische techniek die ‘basisregistratie’ wordt genoemd. Hier beschrijven we deze techniek, die we hebben aangepast van een methode die werd gebruikt door Marion-Poll en collega’s24, en laten we de cruciale smaakcoderingskenmerken zien die het nu gemakkelijk kan meten14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij opnames van sommige soorten sensilla kan het een uitdaging zijn om de spikes van verschillende neuronen te onderscheiden. De suikerneuronen en mechanosensorische neuronen van S en I sensilla produceren bijvoorbeeld pieken met vergelijkbare amplitudes, waardoor het moeilijk is om ze te onderscheiden 4,14. We stellen vast dat het gebruik van een zeer scherpe wolfraamopname-elektrode het afvuren van het mechanosensorische neuron vermindert, evenals de oordeelkun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Zina Berman voor haar steun, Lisa Baik voor haar commentaar op het manuscript en andere leden van het Carlson-laboratorium voor de bespreking. Dit werk werd ondersteund NIH-subsidie K01 DC020145 aan H.K.M.D; en NIH verleent R01 DC02174, R01 DC04729 en R01 DC011697 aan JRC
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Génétique. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
