¹³C_6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית

המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים בצמחים הם מורכבים ומגוונים, וכוללים איברי צבירה ספציפיים ומגוונים מאוד¹. כיום, אתרי הסינתזה הספציפיים והאיברים האחראים למטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא רבים אינם מוגדרים היטב. עמימות זו מציבה מכשול משמעותי לקידום אסטרטגי וליישום של שיטות גידול שנועדו לייעל הן את התשואה והן את האיכות של חומרי מרפא.

ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה וטכניקות תיוג איזוטופים נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי הסינתזה והאתרים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא 2,3,4,5, וכל אחת מהמתודולוגיות הללו מציגה חוזקות ומגבלות ייחודיות, כגון הבדלים ביעילות ובדיוק. גישות ביולוגיה מולקולרית, למשל, מציעות דיוק גבוה באיתור האתרים בתוך מסלולים ביוסינתטיים, אך הן גוזלות זמן רב. התועלת שלהם מוגבלת עוד יותר עבור מינים שאין להם רצפים גנומיים זמינים לציבור, מה שהופך את הטכניקות האלה לפחות מעשיות במקרים כאלה⁶. לעומת זאת, טכניקות תיוג איזוטופים, המשתמשות ביחסים איזוטופיים כמו ³C/¹²C, ²H/¹H ^ו-18O/¹⁶O, מספקות אמצעי מהיר ונגיש לחקור את מנגנוני הסינתזה, ההובלה והאחסון של מטבוליטים שניוניים ^7,8. הם יכולים לחשוף את הפיזור המרחבי של תרכובות אורגניות ואיזוטופים יציבים בעלים, ובכך לאפשר שחזור של תנאי הסביבה שחווים העלים לאורך מחזור חייהם⁹. יתר על כן, היישום של תוויות איזוטופיות חיצוניות, כגון ¹³C_{6-גלוקוז} ¹⁰ ו ¹³C 6-פנילאלנין ¹¹, מאפשר יצירת מטבוליטים משניים המסומנים בפחמן, ומשפר את הבנתנו את ייצורם ותפקודם.

טכניקות מסורתיות לסימון איזוטופים של פחמן נתקלות באתגרים באיתור האיברים הספציפיים האחראים לסינתזה של מטבוליטים שניוניים בשל האופי הספציפי מאוד למין של המסלולים הביוסינתטיים ומנגנוני ההובלה שלהם. ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS) עלתה לגדולה ככלי אנליטי מרכזי בזירה זו, המציע שיטה איתנה למעקב אחר איזוטופים אקסוגניים בסינתזה כימית של תרופות וחקירת תהליכים in vivo כגון ספיגה, חלוקה, מטבוליזם והפרשה¹². הרגישות, הישירות והאמינות המעולות של LC-MS הופכות אותו לבחירה אידיאלית לניטור הייצור של מטבוליטים משניים בצמחים¹³. בתקופה האחרונה, LC-MS הפך מועדף יותר ויותר עבור היישום שלה בטכניקות תיוג איזוטופים חיצוניים, המאפשר הערכה של יעילות התיוג על פני דגימות שונות. מתודולוגיה זו מספקת תובנות קריטיות לגבי האיברים הראשוניים העוסקים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, ומשמשת כהשלמה שלא תסולא בפז לשיטות ביולוגיות לזיהוי איברי הסינתזה של תרכובות אלה^14,15. כתוצאה מכך, גישה זו לא רק מאפשרת השוואה של יעילות התיוג בין דגימות שונות, אלא גם שופכת אור על איברי המפתח המעורבים ביצירת מטבוליטים שניוניים של צמחים, ובכך משפרת את הבנתנו את הביוסינתזה שלהם.

הצגנו שיטה חדשנית המשלבת סימון איזוטופים של פחמן עם זיהוי LC-MS כדי לזהות את האיברים העיקריים האחראים לסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא. פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות כגון אנטי סרטן, אימונומודולציה, ואנטי דלקת¹⁶, ו PPY הוא ביקוש גובר¹⁷. לכן, השתמשנו בשתילי PPY כנושאי מחקר, ופענחנו שהעלים הם האיבר העיקרי לסנתז את ה-Paris saponin VII (PS VII) (איור 1B) באמצעות תיוג ¹³C 6-Glucose הקשור לשיטת LC-MS. הגישה שלנו כללה ארבעה טיפולים שונים הכוללים הזנה של ¹³C_6-Glucose לעלים, קני שורש וצרורות גזע-כלי דם, כמו גם בקרת אי-הזנה. הבחירה של ¹³C_{6-גלוקוז} היא אסטרטגית, כפי שהוא מטבוליזם במהירות לתוך קואנזים אצטיל A באמצעות נשימה, אשר לאחר מכן מקל על סינתזת PS. תוך שימוש בשפע הטבעי של ¹³C, השתמשנו במערכת ספקטרומטר מסה של יחס איזוטופים יציב לכרומטוגרפיה של גז (GC-IRMS) כדי להעריך את יחסי ¹³C/¹²C בין איברי צמח שונים ולנתח את יחסי שיא היונים האיזוטופיים במולקולות PS VII ו-Paris saponins II (PS II) (איור 1B). המתודולוגיה שלנו, הממנפת ¹³מבשרי מטבוליטים משניים צמחיים המסומנים בתווית C וטכניקות ספקטרומטריית מסות חדשניות, מציעה חלופה פשוטה ומדויקת יותר לשיטות סימון איזוטופים פחמן קונבנציונליות. גישה חדשנית זו לא רק מעמיקה את הבנתנו את האיברים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית בצמחי מרפא, אלא גם מניחה בסיס מוצק למחקרים עתידיים במסלולים הביוסינתטיים של תרכובות אלה.