Desenredando las interacciones glicano-proteína: la resonancia magnética nuclear (RMN) al rescate
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que detalla la adquisición, el procesamiento y el análisis de una serie de experimentos de RMN destinados a caracterizar las interacciones proteína-glicano en solución. Se describen las metodologías más comunes basadas en ligandos y proteínas, que sin duda contribuyen a los campos de la glicobiología estructural y los estudios de reconocimiento molecular.
Abstract
Las interacciones de los glicanos con las proteínas modulan muchos eventos relacionados con la salud y la enfermedad. De hecho, el establecimiento de estos eventos de reconocimiento y sus consecuencias biológicas están íntimamente relacionados con las estructuras tridimensionales de ambos socios, así como con sus características dinámicas y su presentación en los compartimentos celulares correspondientes. Las técnicas de RMN son únicas para desentrañar estas características y, de hecho, se han desarrollado y aplicado diversas metodologías basadas en RMN para monitorear los eventos de unión de los glicanos con sus receptores asociados. Este protocolo describe los procedimientos para adquirir, procesar y analizar dos de las metodologías de RMN más potentes empleadas en el campo de la RMN-glicobiología, los experimentos de valoración de diferencia de transferencia de saturación (STD) de 1H-saturación (STD) y 1 H,15N-Heteronuclear de coherencia cuántica simple (HSQC), que ofrecen información complementaria desde la perspectiva de glicanos y proteínas, respectivamente. De hecho, cuando se combinan, ofrecen un poderoso conjunto de herramientas para dilucidar los aspectos estructurales y dinámicos de los procesos de reconocimiento molecular. Este enfoque integral mejora nuestra comprensión de las interacciones glicano-proteína y contribuye al avance de la investigación en el campo de la glicobiología química.
Introduction
El reconocimiento molecular de los glicanos es esencial para muchos procesos relacionados con la salud y la enfermedad. La especificidad y selectividad de los receptores biológicos (lectinas, anticuerpos, enzimas) para los glicanos depende en gran medida del ajuste del precario equilibrio entre los diversos componentes de la entalpía (CH-π y van der Waals, enlaces de hidrógeno, electrostáticos) y la entropía (hidrofobicidad, dinámica, solvatación-desolvatación)1.
Dada la gran diversidad química y la naturaleza dinámica de los glicanos, los métodos de RMN se han empleado ampliamente para diseccionar las interacciones de los glicanos durante más de 25 años2, ya que estas metodologías proporcionan una excelente información sobre los eventos de reconocimiento molecular con detalles precisos, a una resolución atómica 3,4, incluso cuando la evidencia de interacción requerida no se puede recuperar empleando otras metodologías. Como punto clave, la RMN es versátil y permite estudiar eventos dinámicos, a nivel atómico, a diferentes escalas de tiempo, constituyendo la mejor técnica hasta ahora para estudiar la estructura, conformación y dinámica de los glicanos en solución. Sin embargo, desentrañar esta información puede ser un proceso bastante complejo que requiere el empleo de estrategias bien definidas junto con un análisis cuidadoso de los datos5.
Las técnicas de RMN son diversas y, de hecho, hay muchas metodologías que se pueden emplear para desentrañar las interacciones glicano-proteína6. En este trabajo describimos dos enfoques básicos de RMN que se emplean actualmente para descifrar las interacciones glicano-receptor 7,8, haciendo hincapié en cómo desentrañar la presentación del epítopo clave del glicano, así como el sitio de unión de la proteína9.
En cualquier evento de reconocimiento molecular, cuando un receptor se une a un ligando dado, se produce un proceso de intercambio químico que afecta a muchos parámetros de RMN de los participantes en la unión10. Por lo tanto, desde la perspectiva de la RMN, la interacción se puede monitorizar desde el punto de vista del ligando glicano o desde el del receptor de la proteína11. En términos generales, el receptor de la proteína es una biomolécula grande (movimiento de rotación lento, con tasas en la escala de tiempo ns y, por lo tanto, relajación transversal rápida), mientras que el glicano que interactúa puede considerarse como una molécula de tamaño pequeño-mediano (movimiento de rotación rápido, con tasas en la escala de tiempo ps y relajación transversal lenta)12. Desde una perspectiva estándar, las señales de RMN del glicano son estrechas, mientras que las del receptor son amplias13.
Los métodos de RMN basados en ligandos se basan en el cambio drástico que experimentan muchos parámetros de RMN de glicanos al pasar del estado libre al estado unido14. La RMN-STD es la técnica experimental de RMN más empleada para evaluar diversas características de unión a glicanos15, desde la deducción de la existencia de unión en el estado de solución hasta la determinación del epítopo de unión al glicano; es decir, los átomos del ligando que están en contacto con el receptor de la proteína16.
Alternativamente, los métodos de RMN basados en receptores monitorean los cambios que tienen lugar en las señales del receptor de proteínas en presencia del glicano con respecto a los registrados para el estado apo17. Estos se centran principalmente en el cribado de las perturbaciones de cambio químico de las señales de las proteínas entre ambos estados. El experimento más comúnmente empleado es el 1 H-15N HSQC, o sus alternativas TROSY18.
La combinación de ambos enfoques permite aplicar la RMN a muchos sistemas diversos que muestran una amplia gama de afinidades. Sin embargo, para los métodos de RMN basados en receptores, a diferencia de los basados en el ligando, se debe disponer de una cantidad relativamente grande de proteína soluble, no agregada y marcada con isótopos estables (15N).
En este trabajo describimos ambos métodos, destacando sus fortalezas y debilidades. Tenga en cuenta que los pasos básicos descritos en el protocolo sirven como ejemplos para el uso de espectrómetros Bruker. En consecuencia, los nombres de los comandos y parámetros se alinean con los utilizados en TopSpin (el software de control de espectrómetros de Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
La RMN de diferencia de transferencia de saturación (STD-RMN) se ha convertido en el método de RMN más utilizado y versátil para estudiar las interacciones ligando-proteína. Como se muestra arriba, se basa en el fenómeno de transferencia de saturación, y la configuración experimental implica la adquisición de dos espectros unidimensionales (1D) 1H: el espectro de resonancia de entrada y el espectro de resonancia de apagado. Durante el experimento de resonancia, la saturación de protones específicos de la proteína se logra mediante la aplicación de un tren de pulsos de radiofrecuencia de baja potencia durante un cierto período (el tiempo de saturación suele oscilar entre 1 y 3 s). Para evitar la saturación directa del ligando, la frecuencia y la longitud de los pulsos de saturación están optimizadas para irradiar selectivamente protones específicos de la proteína; es decir, deben aplicarse a una frecuencia vacante de cualquier señal de ligando y con una longitud adecuada (Figura 1). Como regla general para pulsos de saturación de 50 ms, se debe mantener una diferencia de 1 ppm desde la región de saturación hasta las señales de ligando más cercanas. Generalmente, los pulsos de saturación selectiva aplicados en la región alifática de la proteína proporcionan mayores efectos de saturación. Alternativamente, los protones aromáticos (6-7 ppm) también se pueden irradiar si la molécula del ligando no contiene ninguna señal aromática. Esto es muy útil para los glicanos naturales, ya que no tienen grupos aromáticos. Una vez que una determinada región de la proteína se irradia selectivamente, la saturación se propaga a lo largo de la proteína a través de la relajación cruzada dipolar 1 H-1H (difusión de espín). Eventualmente, la saturación alcanza los protones de la proteína en el sitio de unión, que luego se transfiere a los protones de azúcar que están en contacto cercano (r < 5 Å) con el receptor a través de NOE intermoleculares 1 H-1H. Obviamente, la intensidad de las señales de los protones del ligando saturado disminuye. Después de recibir la saturación, debido a la cinética de unión, los ligandos unidos transitoriamente (se requiere un intercambio rápido) se disocian y la información de saturación se acumula en el estado libre. Debido a este proceso, los espectros de resonancia de RMN presentan señales disminuidas (Figura 2).
Para exhibir claramente esta perturbación de intensidad de los núcleos 1H de un glicano de unión, se adquiere un espectro de RMN de protones de control (fuera de resonancia) en el que la saturación se aplica lejos de cualquier receptor o señal de carbohidratos (generalmente entre 40-100 ppm), en las mismas condiciones. El espectro 1D sustraído entre la off-resonancia y la on-resonancia muestra exclusivamente las señales de los núcleos 1H del ligando que tienen intensidades modificadas: aquellos que estaban lo suficientemente cerca del sitio de unión del receptor para recibir la magnetización (Figura 2).
Sin embargo, no todos los núcleos 1H del carbohidrato unido reciben la misma cantidad de saturación. Teóricamente, la transferencia de magnetización del receptor al ligando unido depende de la distancia (1/r6). Esto significa que las intensidades de saturación transferida entre los núcleos de glicano 1H contienen información sobre las proximidades espaciales entre los protones del ligando y los del receptor, y las intensidades de RMN de STD son mayores para aquellos protones que están más cerca del receptor. En consecuencia, el experimento de RMN de ETS también permite determinar el epítopo de unión del carbohidrato (Figura 2 y Figura 3) ya que los protones del ligando que se encuentran más cerca de la superficie de la proteína muestran intensidades más altas que aquellos que no participan directamente en la unión.
El experimento se puede aplicar a sistemas con afinidad débil-media, raramente a sistemas con afinidades fuertes en el rango bajo de μM o nM. De hecho, requiere que la tasa de disociación sea rápida en la escala de tiempo de relajación. De lo contrario, la información de transferencia de saturación se pierde a través de la relajación antes de que el ligando se disocie.
Por otro lado, los experimentos de RMN basados en proteínas son únicos para desentrañar la interacción ligando-proteína con precisión a nivel de aminoácidos sin resolver las estructuras de resolución atómica. Examina directamente los fenómenos de reconocimiento molecular en solución sin necesidad de cocristalización. El mapeo del análisis CSP es excepcionalmente potente para descubrir ligandos y mapear el sitio de unión a proteínas (Figura 4 y Figura 5). Este método es aplicable a cualquier rango de afinidades entre el rango de mM y nM, incluso para sistemas donde la tasa de cambio es lenta en la escala de tiempo de cambio químico21.
Sin embargo, es probable que este enfoque no funcione para proteínas con pesos moleculares superiores a 30-40 kDa debido a problemas de relajación. A continuación, se puede utilizar la alternativaTROSY 18 , que es especialmente potente cuando se combina con la deuteración de proteínas. Además, la proteína debe marcarse uniformemente con 15N (y otra muestra doblemente marcada con 13C y 15N para poder completar la asignación de la columna vertebral requerida). Por lo tanto, las condiciones de expresión de proteínas, incluido el sistema de expresión correspondiente, deben optimizarse para poder obtener cantidades de miligramos de proteína. Las proteínas que muestran una tendencia a oligomerizarse o agregarse tampoco son adecuadas para este análisis. El instrumento utilizado en este documento para registrar los datos de RMN es un espectrómetro Bruker de 800 MHz equipado con una criosonda TCI. Sería muy difícil utilizar esta metodología utilizando instrumentos por debajo de 600 MHz o sin una sonda criogénica.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Agencia Estatal de Investigación de España por la Acreditación del Centro de Excelencia Severo Ochoa CEX2021-001136-S, financiada por MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, y al CIBERES, una iniciativa del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, España). También agradecemos a la Comisión Europea por el proyecto GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
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