글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조
Summary
여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.
Abstract
글라이칸과 단백질의 상호 작용은 건강 및 질병과 관련된 많은 이벤트를 조절합니다. 사실, 이러한 인식 사건의 확립과 그 생물학적 결과는 두 파트너의 3차원 구조뿐만 아니라 그들의 역동적인 특징 및 해당 세포 구획에 대한 표현과 밀접한 관련이 있습니다. NMR 기술은 이러한 특성을 풀기 위해 고유하며, 실제로 다양한 NMR 기반 방법론이 개발되어 관련 수용체와 글리칸의 결합 이벤트를 모니터링하는 데 적용되었습니다. 이 프로토콜은 NMR-glycobiology 분야에서 사용되는 가장 강력한 NMR 방법론 중 두 가지인 1H-포화 전달 차이(STD) 및 1 H,15N-Heteronuclear 단일 양자 일관성(HSQC) 적정 실험을 획득, 처리 및 분석하는 절차를 간략하게 설명하며, 각각 글라이칸 및 단백질 관점에서 정보를 보완적으로 제공합니다. 실제로, 이 둘을 결합하면 분자 인식 프로세스의 구조적 측면과 동적 측면을 모두 설명할 수 있는 강력한 툴킷을 제공합니다. 이 포괄적인 접근 방식은 글라이칸-단백질 상호 작용에 대한 이해를 높이고 화학 당생물학 분야의 연구를 발전시키는 데 기여합니다.
Introduction
글라이칸의 분자 인식은 건강 및 질병과 관련된 많은 과정에 필수적입니다. 글라이칸에 대한 생물학적 수용체(렉틴, 항체, 효소)의 특이성과 선택성은 엔탈피의 다양한 구성 요소(CH-π 및 van der Waals, 수소 결합, 정전기)와 엔트로피(소수성, 역학, 용매-탈용매화) 간의 불안정한 균형을 조정하는 데 크게 좌우됩니다1.
글라이칸의 큰 화학적 다양성과 동적 특성을 감안할 때, NMR 방법은 25년 이상 글라이칸 상호 작용을 해부하는 데 널리 사용되어 왔습니다2, 이러한 방법론은 다른 방법론을 사용하여 필요한 상호 작용 증거를 검색할 수 없는 경우에도 원자 분해능 3,4에서 정확한 세부 정보와 함께 분자 인식 이벤트에 대한 탁월한 정보를 제공하기 때문입니다. 요점으로, NMR은 다재다능하며 원자 수준에서, 다양한 시간 규모에서 동적 이벤트를 연구할 수 있게 해주어 용액 내 글라이칸의 구조, 형태 및 역학을 연구하기 위한 최고의 기술을 구성합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 정보를 분리하는 것은 신중한 데이터 분석과 함께 잘 정의된 전략을 필요로 하는 다소 복잡한 과정일 수 있다5.
NMR 기술은 다양하며 실제로 글리칸-단백질 상호 작용을 밝히기 위해 사용할 수 있는 많은 방법론이 있습니다6. 여기에서는 현재 글리칸-수용체 상호 작용을 해독하기 위해 사용되는 두 가지 기본 NMR 접근법을 설명하며7,8, 주요 글라이칸 에피토프와 단백질 결합 부위9의 제시를 푸는 방법에 중점을 둡니다.
임의의 분자 인식 이벤트에서, 수용체가 주어진 리간드에 결합할 때, 결합(10)에 있는 참가자의 많은 NMR 파라미터에 영향을 미치는 화학적 교환 과정이 있다. 따라서, NMR 관점에서, 상호 작용은 글라이칸 리간드의 관점에서 또는 단백질 수용체11의 관점에서 모니터링될 수 있다. 일반적으로 단백질 수용체는 큰 생체 분자(느린 회전 운동, ns 시간 척도의 속도, 따라서 빠른 횡방향 이완)인 반면, 상호 작용하는 글라이칸은 중소형 분자(빠른 회전 운동, ps 시간 척도의 속도 및 느린 횡방향 이완)로 간주될 수 있습니다12. 표준 관점에서 볼 때, 글리칸의 NMR 신호는 좁고 수용체의 NMR 신호는 넓습니다13.
리간드 기반 NMR 방법은 자유 상태에서 결합 상태로 전달할 때 많은 글라이칸 NMR 매개변수가 경험하는 극적인 변화에 의존합니다(14). STD-NMR은 용액 상태에서의 결합의 존재를 추론하는 것부터 글리칸 결합 에피토프의 결정에 이르기까지 다양한 글리칸 결합 특징(15)을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 실험적 NMR 기술이다. 즉, 단백질 수용체(16)와 접촉하는 리간드의 원자.
대안적으로, 수용체-기반 NMR 방법은 apo 상태(17)에 대해 기록된 것들에 대해 글라이칸의 존재 하에 단백질 수용체의 신호에서 발생하는 변화를 모니터링한다. 이들은 주로 두 상태 사이의 단백질 신호의 화학적 이동 섭동을 스크리닝하는 데 중점을 둡니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험은 1 H-15N HSQC 또는 TROSY 대안18입니다.
두 접근 방식의 조합을 통해 광범위한 친화력을 나타내는 많은 다양한 시스템에 NMR을 적용할 수 있습니다. 그러나 수용체 기반 NMR 방법의 경우 리간드를 기반으로 하는 방법과 달리 상대적으로 많은 양의 용해성, 비응집성, 안정 동위원소 표지(15N) 단백질을 사용할 수 있어야 합니다.
여기에서는 두 가지 방법을 모두 설명하고 강점과 약점을 강조합니다. 프로토콜에 설명된 기본 단계는 Bruker 분광계 사용에 대한 예제로 사용됩니다. 결과적으로 명령 및 매개 변수 이름은 TopSpin(Bruker의 분광계 제어 소프트웨어)에서 사용되는 것과 일치합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
포화 전달 차이 NMR(STD-NMR)은 리간드-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 가장 많이 사용되는 다재다능한 NMR 방법이 되었습니다. 위에서 볼 수 있듯이 포화 전달 현상에 의존하며, 실험 설정에는 두 개의 1차원(1D) 1H스펙트럼, 즉 on-resonance¬ 및 ¬off-resonance 스펙트럼의 획득이 포함됩니다. 온 공명 실험 중에 단백질의 특정 양성자의 포화는 특정 기간(포화 시간 범위는 일반적으로 1-3초 범위) 동안 저전력 무선 주파수 펄스 트레인을 적용하여 달성됩니다. 리간드의 직접적인 포화를 피하기 위해, 포화 펄스의 주파수와 길이는 단백질의 특정 양성자를 선택적으로 조사하도록 최적화됩니다. 즉, 모든 리간드 신호의 빈 주파수에 적절한 길이로 적용되어야 합니다(그림 1). 일반적으로 50ms 포화 펄스의 경우 포화 영역에서 가장 가까운 리간드 신호까지 1ppm의 차이를 유지해야 합니다. 일반적으로, 단백질의 지방족 영역에 적용되는 선택적 포화 펄스는 증가된 포화 효과를 제공합니다. 대안적으로, 리간드 분자가 어떠한 방향족 신호도 포함하지 않는 경우 방향족 양성자(6-7 ppm)를 조사할 수 있다. 이것은 방향족 그룹을 가지고 있지 않기 때문에 자연적으로 발생하는 글라이칸에 매우 유용합니다. 단백질의 특정 영역에 선택적으로 조사되면 포화도는 쌍극자 1 H-1H 교차 이완(스핀 확산)을 통해 단백질을 따라 전파됩니다. 결국, 포화도는 결합 부위의 단백질 양성자에 도달하고, 이는 분자간 1 H-1H NOE를 통해 수용체와 밀접하게 접촉(r < 5 Å)되는 당 양성자로 전달됩니다. 분명히, 포화 리간드 양성자의 신호 강도는 감소합니다. 포화를 받은 후 결합 역학으로 인해 일시적으로 결합된 리간드(빠른 교환이 필요함)가 해리되고 포화 정보가 자유 상태로 축적됩니다. 이 과정으로 인해 NMR 온 공명 스펙트럼은 감소된 신호를 나타냅니다(그림 2).
결합 글라이칸의 1H핵의 이러한 강도 섭동을 명확하게 나타내기 위해, 포화가 동일한 조건에서 수용체 또는 탄수화물 신호(보통 40-100ppm 사이)에서 멀리 떨어진 곳에 적용되는 제어 양성자 NMR 스펙트럼(오프 공명)을 획득합니다. off-resonance와 on-resonance 사이의 빼진 1D 스펙트럼은 강도가 수정된 리간드의 1H핵의 신호, 즉 자화를 받을 수 있을 만큼 수용체 결합 부위에 충분히 가까운 신호를 독점적으로 보여줍니다(그림 2).
그럼에도 불구하고 결합 된 탄수화물의 모든 1H핵이 동일한 양의 포화도를받는 것은 아닙니다. 이론적으로, 수용체에서 결합된 리간드로의 자화 전달은 거리에 따라 달라집니다(1/r6). 이는 글리칸 1H핵 사이의 전이 포화 강도가 리간드의 양성자와 수용체의 양성자 사이의 공간적 근접성에 대한 정보를 포함하고 STD NMR 강도가 수용체에 더 가까운 양성자에 대해 더 크다는 것을 의미합니다. 따라서 STD NMR 실험은 단백질 표면에 더 가깝게 위치한 리간드의 양성자가 결합에 직접 참여하지 않는 것보다 더 높은 강도를 보여주기 때문에 탄수화물의 결합 에피토프를 결정할 수도 있습니다(그림 2 및 그림 3).
이 실험은 약한 친화도-중간 친화도를 가진 시스템에 적용할 수 있으며, 낮은 μM 또는 nM 범위에서 강한 친화도를 가진 시스템에는 드물게 적용할 수 있습니다. 실제로, 이완 시간 척도에서 해리 속도가 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 리간드가 해리되기 전에 이완을 통해 포화 전달 정보가 손실됩니다.
반면에 단백질 기반 NMR 실험은 원자 분해능 구조를 해결하지 않고 아미노산 수준 정확도로 리간드-단백질 상호 작용을 밝히는 데 독특합니다. 공결정화(co-crystallization) 없이 용액 내 분자 인식 현상을 직접 검사합니다. CSP 분석 매핑은 리간드를 발견하고 단백질 결합 부위를 매핑하는 데 매우 강력합니다(그림 4 및 그림 5). 이 방법은 mM과 nM 범위 사이의 친화도의 모든 범위에 적용 가능하며, 화학적 이동 시간 척도(21)에서 환율이 느린 시스템의 경우에도 적용할 수 있다.
그럼에도 불구하고 이 접근법은 이완 문제로 인해 분자량이 30-40kDa 이상인 단백질에는 효과가 없을 것입니다. 그런 다음 TROSY 대안18 을 사용할 수 있으며, 단백질 중수소화와 결합할 때 특히 강력합니다. 또한, 단백질은 15N으로 균일하게 표지되어야 합니다(그리고 필요한 백본 할당을 완료할 수 있도록 13C 및 15N으로 이중 표지된 또 다른 샘플). 따라서, 해당 발현 시스템을 포함한 단백질 발현 조건은 밀리그램 양의 단백질을 얻을 수 있도록 최적화되어야 합니다. 올리고머화(oligomerize) 또는 응집(응집) 경향을 보이는 단백질도 이 분석에 적합하지 않습니다. NMR 데이터를 기록하기 위해 본 명세서에서 사용되는 기기는 TCI cryoprobe가 장착된 Bruker 800MHz 분광계이다. 이 방법론을 600MHz 미만의 기기를 사용하거나 극저온 프로브 없이 사용하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCIN/AEI/10.13039/501100011033가 후원하는 Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S와 Instituto de Salud Carlos III(ISCIII, Madrid, Spain)의 이니셔티브인 CIBERES에 대해 스페인의 Agencia Estatal de Investigación에 감사드립니다. 우리는 또한 GLYCOTWINNING 프로젝트를 위해 유럽연합 집행위원회(European Commission)에 감사를 표합니다.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
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