解开聚糖-蛋白质相互作用：核磁共振 （NMR） 来拯救

1. 饱和转移差 NMR （STD-NMR） 注：后续几行概述了采集、处理和分析 STD-NMR 实验的基本程序。这些步骤用于举例说明该技术在检测配体结合和阐明配体结合表位方面的效用。要更深入地了解 NMR 实验的设计和采集，请参考 NMR 仪器随附的相应制造商手册。 收购用蛋白质-配体复合物制备样品。聚糖：凝集素摩尔比在 10：1 和 100：1 之间，蛋白质浓度范围在 0.01 和 0.2 mM 之间。对于 h半乳糖凝集素-7 与 LacNAc 的相互作用，在 pH 7.4 的氘代磷酸盐缓冲盐水中使用 50：1 的蛋白质：配体比例。注：蛋白质受体应该是纯的，并且可溶于所选缓冲液中（在 STD-NMR 实验的情况下，最好使用相应缓冲液的氘化版本，以减少可能的 1H NMR 信号干扰）。使用分光光度计预先检查蛋白质的浓度，以测量 280 nm 处的吸光度。 使用移液管从制备的溶液中，将总体积为 0.6 mL 的 NMR 管转移到 5 mm NMR 管中。 在所需温度下准备 NMR 仪器（常见实验温度在 10 °C 和 45 °C 之间）。使用 edte 命令打开温度控制监视器并设置所需的温度。对于 h半乳糖凝集素-7/LacNAc 研究，温度设置为 25 °C。 生成包含 zg 脉冲序列的新数据集。对于简单的操作，请打开现有实验并键入 edc 命令。此时会出现一个对话框，定义实验的标题、特性（样品规格、溶剂）和一些参数。 如果需要更改原始脉冲序列，请在 ased（参数）和 AcquPars（采集参数）窗口中导航。此时，从波谱仪的库中选择所需的脉冲程序。 对于标准的 1H NMR 波谱，请从可用列表中选择 zg 脉冲序列。注：在含水量增加的样品中，可能需要使用水抑制方案来提高信噪比。使用 zgesgp 等脉冲序列是可取的，它激发雕刻模块，提供出色的抑制效果，但控制剩余信号的相位。请参阅制造商的 NMR 教程，了解有关水抑制方案类型及其主要特性的更多信息。 通过激活样品提升空气，将 NMR 样品插入探头。使用 ej 命令，将样品放在磁力架顶部，然后使用 ij 命令停用样品提升。注：要使用自动进样器将样品注入磁力架，请使用命令 sx ，后跟位置编号 n，对应于 NMR 管在自动进样器托盘中的位置。 通过键入命令 lock，然后从菜单中选择适当的溶剂来锁定溶剂信号。 将样品插入探头后，使用自动模块 atma 或手动模块 atmm 完成调谐和匹配过程。 通过 topshim gui 命令启动自动填充。这将打开一个图形界面，其中将选择并启动垫片维度 1D。注意：为了最大限度地减少由于细微的磁场或温度变化而导致的匀场不稳定性，可以激活自动匀场进行实验采集。这可以通过访问 BSMS 控制窗口并单击 autoshim 来执行。变为绿色高亮显示表示 autoshim 已激活。请注意，使用自动填充物时，必须忽略潜在的样品不稳定问题。因此，建议在使用 autoshim 时谨慎。 确定 1小时 90° 脉冲。这可以通过 pulsecal 命令自动执行。 在 AcquPars 窗口中修改各种参数。对于常规的 1H NMR 波谱，将扫描次数 （NS） 设置为 32，将所需的波谱窗口 （SW） 设置为 ca。12 页/分钟。注： zgesgp 脉冲序列包括一个用于溶剂抑制的模块，以消除残余 HDO 信号，该信号应位于光谱中间的中心。为此，必须在 AcquPars 中准确定义 O1。 设置接收器增益以避免使用自动命令 raga 溢出。 现在，使用 zg 命令获取标准的 1H NMR 波谱。 采集完成后，通过 efp 命令处理频谱。使用 TopSpin 菜单栏应用基线和相位校正。注：观察到来自聚糖和蛋白质的 1H NMR 信号（图 1）。如第 1.1.14 节所述，建议对获得的 NMR 波谱进行详细分析以实施 STD NMR 实验。 创建一个新数据集并上传 STD NMR 脉冲序列，以与第 1.1.4 节中 1H NMR 实验相同的方式使用。在布鲁克仪器中，脉冲程序目录中提供了不同的脉冲序列，均命名为 stddiffXXX。最简单的一个 （stddiff） 不包括任何水抑制方案或蛋白质抑制过滤器。对于具有显著 H2O 含量的样品，请选择 stddiffgp19 或 stddiffesgp 序列，其中包括水门或激发雕刻模块。对于以强蛋白质 NMR 信号为背景的谱图，请选择 stddiffXXX.3 序列。在每种情况下，优化每个水抑制模块的相应特定参数（即水门事件方案中的 d19）。 定义 STD NMR 实验的关断谐振频率和导通谐振频率。在 FQ2LIST 条目下的 ased 窗口的 AcquPars 参数中找到频率列表。以赫兹为单位定义的导on-resonance和off-resonance频率必须手动写入列表中，并以新名称保存。这个新列表将用于 STD-NMR 实验。对于典型游离寡糖，选择无游离寡糖信号的光谱区域的导通谐振频率，通常约为 δ（1H） 0 或 6.6 ppm（图 1）。将非谐振频率设置在不显示任何配体或蛋白质质子的区域。它可以安全地设置为 +18000 或 -18000 Hz。 在 ased 窗口的 AcquPars 参数中定义要在饱和时间内使用的整形脉冲。注意：有很多可能性。可以安全地采用 Gaussian 或 Eburp 形状，选择性脉冲的 90° 宽度为 50 ms。 在 AcquPars 部分设置相应的参数。设置 1小时 90° 脉冲长度。 设置形状脉冲的功率值（通过形状工具估计）。 设置总饱和时间。可以定期使用 1 s 到 4 s 之间的值。 将 relaxation delay 设置为 3 s。 将扫描次数 （NS） 设置为 8 的倍数。通常，它设置为 256、512 或 1024，以便在每个频率上以 2 为一组获得适当的信噪比。 将虚拟扫描次数 （DS） 设置为 8。 将 F2 中的点数设置为 16k、32k 或 64k。注意：F2 中的点数增加将导致分辨率和信噪比的提高。因此，强烈建议至少使用 16k 个数据点。 在 F1 中设置点数。这是要使用的频率数，在本例中为 2 （on-resonance 和 off-resonance）。注：按照惯例，F2 是指直接维度，即直接对自由感应衰减 （FID） 进行采样的维度，而 F1 表示间接维度。 设置接收器增益 （RG） 以避免使用自动命令 raga 溢出。 使用命令 expt 计算总实验的时间。 通过 zg 命令发送 Experiment 进行采集。 请始终在几分钟后检查实验是否正常运行。 加工注意：应用上述协议后获得伪 2D 光谱。行数对应于使用的频率数，通常为两个： on-resonance 和 off-resonance。处理第一个实验的 fid。对 fid 编号 1 进行傅里叶变换（通过 efp 命令）并选择已处理光谱的目标（选择 procno 编号）。或者，使用 rser 1 命令读取第一个 fid。 然后，通过 lb 命令（通常为 3-5 Hz）调整线路展宽因子和相位。要手动相位，请单击 Process 选项卡，然后单击 adjust phase 子菜单。通过单击并拖动相应的按钮来执行零阶和一阶校正。保存阶段划分结果。此外，通过命令 abs 执行基线校正。 读取第二个实验的 fid，并使用相同的线展宽因子进行傅里叶变换（通过 efp 命令）。使用相同的相位参数和基线校正调整相位，并使用不同的代码保存处理后的光谱。 使用多重可视化 （ Δ） 中的可用按钮读取两个处理过的光谱，并使用多重可视化 （Δ） 中的可用按钮减去它们（非谐振 – 谐振）。新频谱是 STD NMR 频谱，它以不同的代码保存。 将 STD NMR 波谱与非谐振波谱叠加。打开非谐振频谱 （fid 1） 并键入 .md 命令以打开多显示窗口。然后，上传 STD 频谱。 比较 STD NMR 波谱中信号的频率和强度（自动显示在右上角）。这提供了有关靠近蛋白质的质子及其相对接近度的所需信息。相对强度越高，它们越接近蛋白质（图 2）。 使用相应的软件测量非共振实验中的强度（积分）。在 TopSpin 中，转到 Analyse > Integrate。定义区域并将积分写入文件 （I0）。 使用相同的参数测量 STD NMR 实验中的强度（积分），并将它们写入文件 （ISTD）。 使用以下公式计算每个质子信号的 STD 值：STD = （ISTD）/I0.注：注：使用信号积分计算 STD 值需要充分分离质子信号。当发生信号重叠时，例如寡糖重叠时，可以通过评估 STD 和非共振光谱之间的信号强度比来确定 STD 值。 以百分比形式计算相对 STD。为此，请给质子一个 100% 的值，该值在非共振和 STD NMR 波谱的强度之间表现出最大差异。相应地计算其他质子的相对 STD 强度。注意：正确分析 STD 数据，特别是用于确定配体结合表位，需要完全分配配体的 1H 信号。因此，强烈建议在采集 STD 光谱之前完成此任务。 2. 1个 H-15N HSQC 实验 注：以下几行详细介绍了采用 1 H-15N HSQC 实验来监测受体（凝集素）的 1H 和 15N NMR 共振的化学位移变化，以响应配体（寡糖）含量增加的存在19。基于提取数据的化学位移扰动 （CSP） 分析对于鉴定结合配偶体以及绘制蛋白质结合界面和确定结合亲和力非常有价值。要更深入地了解 NMR 实验的设计和采集，请参考 NMR 仪器随附的相应制造商手册。 收购和加工用感兴趣的凝集素制备样品。确保受体在骨架和侧链中的每个氨基酸残基中都完全 15N 标记。通常，为了检测光谱中可水交换的 HN 交叉峰，采用 H2O：D2O 的 90：10 混合物来制备缓冲溶液。所需的凝集素浓度范围在 0.05 至 0.2 mM 之间，具体取决于 15N 标记受体的可用性和必要的信噪比。注意：蛋白质在整个实验时间内应保持稳定，在 NMR 管中不得产生可见的沉淀物。此外，它应该是纯的并且可溶于所选缓冲液。HSQC 交叉峰的完整 1H 和 15N 分配应该事先进行，以便 HSQC 谱图中的每个交叉峰都使用与特定氨基酸残基相对应的标记来识别。 从该制备中，将总体积为 0.6 mL 转移到 5 mm NMR 管中。 将 NMR 仪器设置在所需的温度。请参阅步骤 1.1.3 并执行相同的操作。 创建新数据集。请参阅步骤 1.1.4 并重复这些操作。 按照步骤 1.1.5 中的说明将 NMR 样品插入探头。 锁定溶剂信号。要启动锁定程序，请使用命令 lock 并从菜单中选择适当的溶剂。可以在锁定窗口中跟踪锁定信号。设置锁定增益，以便在锁定窗口中显示锁定信号。 自动 （通过命令 atma） 或手动 （ atmm 命令将打开 ATM 控制窗口以调整摆动曲线） 完成调谐和匹配过程。 使用 TopShim 工具设置最佳垫片。使用命令 topshim gui。请参阅步骤 1.1.8 中的说明。 确定 1H 90° 脉冲长度（如步骤 1.1.9 中所述）和偏移频率（命令 o1calib 将运行交互式 O1 校准程序，检索偏移频率）。当采用溶剂抑制方案的实验时，后一个参数极为重要。 按照 1.1.4 节中的说明创建新数据集。要减少或消除 H2O 信号的干扰，请使用脉冲序列 zgesgp。 通过在 AcquPars 窗口中修改各种参数来设置实验。如前所述，引入 1H 90° 脉冲长度和偏移量 （o1），并将扫描次数 （NS） 设置为 32，将光谱窗口 （SW） 设置为 12 ppm 左右。 使用 Topspin 菜单栏中的 Shape 工具确定整形脉冲的功率电平。 使用自动命令 rga 设置接收器增益。 使用 zg 命令获取实验并处理得到的 FID 以获得 1H NMR 波谱。 创建一个新数据集用于获取 1 H-15N HSQC NMR 实验。在 AcquPars 选项卡中，选择脉冲程序目录中可用的脉冲程序 hsqcetfpf3gp 。 设置实验。使用命令 getprosol 加载默认形状、幂和时间。然后，更新 1H 90° 脉冲长度和偏移的值。 定义以下参数。将松弛延迟设置为 1-5 秒。 将扫描次数设置为 4 的倍数。通常，它设置为 8、16、32 或 64 以获得适当的信噪比。 将虚拟扫描次数设置为 128。 将 F2 中的点数设置为 1k、2k 或 4k。 设置 F1 中的点数：要使用的 t1 增量数。根据光谱窗口，该值介于 128 和 256 之间。 将 15N 维度的光谱窗口中心调整为 δ 117 ppm，并将相应的光谱宽度设置为 36 ppm。这些值需要针对每个特定系统进行优化。 设置接收器增益以避免溢出（通过使用 rga 命令） 计算总实验的时间。典型的实验时间约为 1 小时。 键入 zg 以发送实验进行采集。注意：请始终在几分钟后检查实验是否正常运行。 使用命令 xfb 处理 FID。使用“处理”选项卡中的命令 abs2 和相位校正执行基线校正。要手动相位，请单击 adjust phase 子菜单，然后选择 2D 光谱的几个交叉峰。然后，通过单击并拖动相应的按钮，按顺序将零和一阶校正应用于行和列。保存阶段划分结果。 保存生成的 2D 光谱。 制备配体的高浓度储备溶液。典型值为 50-100 mM。 从高浓度的聚糖储备液中，将相应体积（几微升）转移到含有受体的 NMR 管中，以获得所需的蛋白质：配体摩尔比并记录光谱。注：此步骤启动滴定系列，其中配体被滴定到蛋白质样品中。必须针对每种特定情况确定适当的蛋白质与配体比率。如果结合亲和力完全未知，建议在初始点中使用亚化学计量量的配体。 对新制备的样品执行步骤 2.1.1 至 2.1.19。 对蛋白质与配体比率增加的样品重复步骤 2.1.21 和 2.1.22。注：滴定系列数据的准确拟合需要采集多个 1 H-15N-HSQC 实验，涵盖广泛的蛋白质与配体比率，包括实现蛋白质饱和所需的比率。 分析使用适当的软件可视化载脂蛋白物种的处理后 2D HSQC 光谱：TopSpin、MestReNova 和 CCPNMR 都是处理 NMR 数据的合适程序。注意：这是蛋白质的指纹图谱。观察到的 1H 和 15N 化学位移取决于每个氨基酸的相应化学环境，这在很大程度上取决于蛋白质的 3D 结构。这个谱图谱称为蛋白质指纹图谱。分散良好的 2D 1 H-15N HSQC 谱图，其中所有交叉峰都显示出均匀的强度，强烈表明存在充分折叠的蛋白质19。 生成所有交叉峰的 1H 和 15N 频率列表。使用补充软件，例如 CCPNMR 程序20，可以帮助完成该过程。 将第一滴定点或第二滴定点的谱图叠加到 apo 蛋白的谱图上。为此，请打开与 apo 状态对应的 2D 光谱，单击 Multiple display（多重显示）选项卡，然后添加第二个 2D 光谱。两个光谱的目视检查提供了有关配体和蛋白质之间是否存在相互作用的信息。注：从蛋白质的角度来看，结合的存在提供了直接参与识别事件的氨基酸化学环境的变化，以及随之而来的化学位移扰动 （CSP）。 对每个滴定点重复步骤 2.2.2 和 2.2.3，为不同光谱中的所有交叉峰生成 1H 和 15N 频率列表，对应于不同的蛋白质 – 配体摩尔比。注：无需执行任何新的交叉峰分配即可测量每个滴定点的化学位移。在凝集素：聚糖相互作用中常见的快速交换机制中，可以简单地在整个滴定过程中跟踪峰的逐渐移动。 检查最后一个滴定点是否与前一次添加相比，基本上没有化学位移扰动。这一事实表明蛋白质结合位点已被配体饱和，配体高度过量。 使用以下公式计算最大化学位移扰动 （maxCSP）：ΔH 和 ΔδN 分别是载脂蛋白状态和最后一个滴定点之间 1H 和 15N 频率的化学位移差异。 在 2D 图的垂直 y 轴上绘制最大化学位移扰动 （maxCSP） 与相应的氨基酸残基（在水平 x 轴上）的关系。 目视检查显示蛋白质结合状态和 apo 状态之间最大 CSP 的氨基酸残基。它们很可能属于结合位点或与其相邻。 如果蛋白质的 3D 结构可用，请使用适当的软件（如 PyMOL 或 BIOVIA Discovery studio）打开相应的 PDB。这些分子可视化程序广泛用于结构生物学应用。选择显示最高 maxCSP（高于标准偏差的两倍）的残基和特定颜色，以定位推定的结合位点。 在快速交换机制的情况下，从观察到的 CSP 在每个点 （Δδobs） 的 CSP 相对于该点的特定蛋白质 [P] 和配体 [L] 浓度的非线性最小二乘拟合中估计解离常数（KD）：注：此公式可应用于显示清晰隔离信号的交叉峰。对获得的值进行平均，以提供 KD 的估计值。