Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

Les ostéoclastes (OC) sont des types cellulaires polyvalents dérivés de l’hématopoïétique ^1,2 qui sont couramment utilisés par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses ^3,4, la recherche sur le cancer ^5,6, l’ingénierie tissulaire ^7,8 et la recherche sur les endoprothèses ^9,10. Néanmoins, la différenciation des CO peut être difficile car la fusion des précurseurs mononucléaires en CO multinucléés est nécessaire pour créer des CO fonctionnels¹¹. Plusieurs facteurs biologiques, tels que l’activateur du récepteur du ligand NF-κB (RANKL) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), sont nécessaires à la différenciation du CO. Il a été rapporté que le M-CSF a un effet positif sur la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et l’expression de RANK 12,13,14. D’autre part, RANKL se lie à RANK, qui active des cascades de signalisation en aval qui induisent l’ostéoclastogenèse. L’activation est médiée par le facteur 6 associé au récepteur TNF (TRAF6), qui conduit à la dégradation du facteur nucléaire de l’activateur du gène polypeptidique léger kappa dans l’inhibiteur des lymphocytes B, alpha (IκB-α), une protéine de liaison qui se lie aux dimères NF-kB^16,17. Par conséquent, la dégradation de l’IκB-α libère des dimères NF-kB, qui se transloquent ensuite dans le noyau et induisent l’expression des facteurs de transcription c-Fos et Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1). Ceci, à son tour, déclenche la transcription d’une multitude de protéines liées à la différenciation OC ^15,18. Des protéines régulées à la hausse telles que DC-Stamp et Atp6v0d2 interviennent dans la fusion cellule-cellule des précurseurs de CO, conduisant à la formation de syncytium 19,20,21.

En ce qui concerne les cellules primaires humaines, les PBMC CD34⁺ et CD14⁺ sont actuellement les types de cellules les plus utilisés pour la différenciation en OC²². Cependant, cette approche est limitée par l’hétérogénéité au sein de la population CD34⁺ des cellules prélevées sur des donneurs²³ et leur capacité d’extensibilité limitée. Les CSPi humaines constituent une source alternative de CO. Comme ils peuvent être propagés^{indéfiniment 24}, ils permettent l’évolutivité et la mise à l’échelle de la production de CO. Cela permet de différencier un grand nombre de CO, ce qui facilite la recherche sur les CO.

Plusieurs protocoles pour la différenciation des CSPi en CO ont été publiés 25,26,27. L’ensemble du processus de différenciation peut être divisé en une partie de propagation des CSPi, une partie de différenciation mésodermique et hématopoïétique et une partie de différenciation des CO. La propagation des cellules iPS avant le processus de différenciation permet la mise à l’échelle de la production de CO avant la différenciation. Plusieurs approches existent en ce qui concerne la différenciation mésodermique et hématopoïétique. Traditionnellement, la formation du corps embryoïde (EB) a été utilisée pour différencier les cellules hématopoïétiques, mais les approches basées sur des monocouches représentent une autre stratégie de différenciation hématopoïétique qui ne nécessite pas d’induction EB. Néanmoins, les systèmes monocouches semblent nécessiter une optimisation supplémentaire, car nous et d’autres avons constaté que les approches basées sur l’EB étaient plus robustes pour la différenciation des OC.

Ici, nous décrivons la différenciation des CO des iPSC humains à l’aide d’un protocole basé sur EB. Ce protocole a été adapté de Rössler et ^al.26 et modifié pour augmenter la robustesse et permettre la cryoconservation pendant le processus de différenciation. Tout d’abord, nous n’avons récolté des cellules hématopoïétiques qu’une seule fois après 10 jours de différenciation. Les cellules hématopoïétiques ont ensuite été cryoconservées pour permettre une plus grande flexibilité pendant le processus de différenciation. De plus, nous avons augmenté la densité d’ensemencement des cellules hématopoïétiques de 1 x 10⁵ à 2 x 10⁵ cellules/cm² pour la différenciation du CO. Un milieu humain sans sérum iPSC plus récent (hiPSC-SFM, voir le tableau des matériaux) a été utilisé, et le revêtement des puits a été effectué avec 200 à 300 μg/mL d’un extrait de membrane basale (voir le tableau des matériaux) au lieu de 0,1 % de gélatine. La pénicilline/streptomycine n’a pas été ajoutée aux médias.

Le protocole de Rössler et ^al.26 a été adapté à l’origine d’une CSPi à un protocole de différenciation des macrophages²⁸ qui utilise la formation d’EB pour la différenciation hématopoïétique. Bien que la formation d’EB ait été utilisée pendant une longue période par les chercheurs pour la différenciation hématopoïétique^29,30, plusieurs méthodes d’induction d’EB ont été décrites dans la littérature, telles que l’agrégation spontanée, la centrifugation dans une plaque à fond rond, la culture de gouttes suspendues, la culture de bioréacteurs, la culture de tubes coniques, les vaisseaux latéraux à rotation lente et la culture de gel de micromoules³¹. Ce protocole utilise la centrifugation de cellules iPS dissociées dans une plaque à puits à fond rond pour rapprocher les cellules iPSC individuelles les unes des autres et permettre la formation de sphères (EB), comme décrit ci-dessous.