Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll stellt die Differenzierung humaner Osteoklasten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) dar und beschreibt Methoden zur Charakterisierung von Osteoklasten und Osteoklastenvorläufern.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Vermehrung und Passage von humanen iPS-Zellen und ihre Differenzierung in Osteoklasten. Zunächst werden iPS-Zellen in eine einzellige Suspension dissoziiert, um sie in der Induktion des Embryoidkörpers weiter zu verwenden. Nach der mesodermalen Induktion durchlaufen die Embryoidkörper eine hämatopoetische Differenzierung, wodurch eine schwimmende hämatopoetische Zellpopulation entsteht. Anschließend durchlaufen die geernteten hämatopoetischen Zellen einen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktorreifungsschritt und schließlich eine Osteoklastendifferenzierung. Nach der Osteoklastendifferenzierung werden die Osteoklasten durch eine Färbung für TRAP in Verbindung mit einer methylgrünen Kernfärbung charakterisiert. Osteoklasten werden als mehrkernige, TRAP+-Polykaryonen beobachtet. Ihre Identifizierung kann durch die Cathepsin-K-Färbung weiter unterstützt werden. Knochen- und Mineralresorptionsassays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung und bestätigen die Identität von echten Osteoklasten. Dieses Protokoll stellt eine robuste und vielseitige Methode zur Unterscheidung menschlicher Osteoklasten von iPS-Zellen dar und ermöglicht eine einfache Anwendung in Anwendungen, die große Mengen an funktionellen menschlichen Osteoklasten erfordern. Denkbar wären Anwendungen in den Bereichen Knochenforschung, Krebsforschung, Tissue Engineering und Endoprothesenforschung.
Introduction
Osteoklasten (OCs) sind hämatopoetische 1,2, vielseitige Zelltypen, die häufig von Forschern in Bereichen wie der Erforschung von Knochenkrankheiten 3,4, derKrebsforschung 5,6, dem Tissue Ingénierie 7,8 undder Endoprothesenforschung 9,10 verwendet werden. Nichtsdestotrotz kann die OC-Differenzierung eine Herausforderung darstellen, da die Fusion von mononukleären Vorläufern zu mehrkernigen OCs notwendig ist, um funktionelle OCs zu erzeugen11. Mehrere biologische Faktoren, wie z.B. der Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL) und der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), sind für die OC-Differenzierung notwendig. Es wurde berichtet, dass M-CSF einen positiven Effekt auf die Zellproliferation, das Zellüberleben und die RANK-Expression hat 12,13,14. Auf der anderen Seite bindet RANKL an RANK, das nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, die die Osteoklastogenese induzieren. Die Aktivierung wird über den TNF-Rezeptor-assoziierten Faktor 6 (TRAF6) vermittelt, der zum Abbau des nukleären Faktors des Kappa-Light-Polypeptid-Genverstärkers im B-Zell-Inhibitor alpha (IκB-α) führt, einem Bindungsprotein, das NF-kB-Dimerebindet 16,17. Daher werden beim Abbau von IκB-α NF-kB-Dimere freigesetzt, die dann in den Zellkern translozieren und die Expression der Transkriptionsfaktoren c-Fos und Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1) induzieren. Dies wiederum löst die Transkription einer Vielzahl von Proteinen aus, die mit der OC-Differenzierung zusammenhängen15,18. Hochregulierte Proteine wie DC-Stamp und Atp6v0d2 vermitteln die Zell-Zell-Fusion von OC-Vorläufern, was zur Bildung von Synzytium führt 19,20,21.
In Bezug auf humane Primärzellen sind CD34+ und CD14+ PBMCs derzeit die am häufigsten verwendeten Zelltypen für die Differenzierung in OCs22. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Heterogenität innerhalb der CD34+ -Population von geernteten Zellen von Spendern23 und ihre begrenzte Erweiterbarkeit begrenzt. Humane iPS-Zellen stellen eine alternative Quelle für OCs dar. Da sie unbegrenzt vermehrt werden können24, ermöglichen sie eine Erweiterbarkeit und Hochskalierung der OC-Produktion. Dies ermöglicht die Differenzierung einer großen Anzahl von OCs, was die OC-Forschung erleichtert.
Es wurden mehrere Protokolle zur Differenzierung von iPS-Zellen in OCs veröffentlicht 25,26,27. Der gesamte Differenzierungsprozess kann in einen iPSC-Propagationsteil, einen mesodermalen und einen hämatopoetischen Differenzierungsteil und eine OC-Differenzierung unterteilt werden. Die Vermehrung von iPS-Zellen vor dem Differenzierungsprozess ermöglicht die Hochskalierung der OC-Produktion vor der Differenzierung. Es existieren mehrere Ansätze zur mesodermalen und hämatopoetischen Differenzierung. Traditionell wurde die Bildung von Embryoidkörpern (EB) zur Differenzierung hämatopoetischer Zellen verwendet, aber Monolayer-basierte Ansätze stellen eine weitere hämatopoetische Differenzierungsstrategie dar, die keine EB-Induktion erfordert. Nichtsdestotrotz scheinen monolayer-basierte Systeme weiterer Optimierung zu bedürfen, da wir und andere festgestellt haben, dass EB-basierte Ansätze robuster für die Differenzierung von OCs sind.
Hier beschreiben wir die Differenzierung von OCs von humanen iPSCs mit Hilfe eines EB-basierten Protokolls. Dieses Protokoll wurde von Rössler et al.26 adaptiert und modifiziert, um die Robustheit zu erhöhen und die Kryokonservierung während des Differenzierungsprozesses zu ermöglichen. Erstens haben wir hämatopoetische Zellen nur einmal nach 10 Tagen der Differenzierung geerntet. Die hämatopoetischen Zellen wurden dann kryokonserviert, um mehr Flexibilität während des Differenzierungsprozesses zu ermöglichen. Zusätzlich haben wir die hämatopoetische Zellaussaatdichte von 1 x 105 auf 2 x 105 Zellen/cm2 für die OC-Differenzierung erhöht. Es wurde ein neueres humanes iPSC-serumfreies Medium (hiPSC-SFM, siehe Materialtabelle) verwendet, und die Beschichtung der Wells wurde mit 200-300 μg/ml eines Basalmembranextrakts (siehe Materialtabelle) anstelle von 0,1% Gelatine durchgeführt. Penicillin/Streptomycin wurde den Medien nicht hinzugefügt.
Das Protokoll von Rössler et al.26 wurde ursprünglich von einem iPSC-Protokoll auf ein Makrophagen-Differenzierungsprotokoll28 adaptiert, das die EB-Bildung zur hämatopoetischen Differenzierung nutzt. Während die EB-Bildung von Forschern seit längerer Zeit für die hämatopoetische Differenzierung verwendet wird29,30, wurden in der Literatur mehrere Methoden der EB-Induktion beschrieben, wie z. B. spontane Aggregation, Zentrifugation in einer Well-Platte mit rundem Boden, hängende Tropfenkultur, Bioreaktorkultur, konische Röhrchenkultur, langsam drehende laterale Gefäße und Mikroformgelkultur31. Dieses Protokoll verwendet die Zentrifugation von dissoziierten iPS-Zellen in einer Well-Platte mit rundem Boden, um einzelne iPSC-Zellen in die Nähe zueinander zu bringen und die Bildung von Kugeln (EB) zu ermöglichen, wie im Folgenden beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und robuste Methode zur Unterscheidung von iPS-Zellen in OCs. Dennoch gibt es einige Fallstricke, die während des gesamten Differenzierungsprozesses auftreten können. Humane iPSC-Linien, die aus Zellen unterschiedlicher Gewebeherkunft erzeugt wurden, wurden mit diesem Protokoll erfolgreich differenziert33. Beim Einfrieren von iPS-Zellen (siehe Protokollschritt “3. Einfrieren von iPS-Geräten”) wurde eine Vertiefung zum Zeitpunkt des Durchgangs wieder in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern des Giachelli-Labors für ihre technische Hilfe und Unterstützung. Wir danken dem W. M. Keck Mikroskopiezentrum und dem Leiter des Keck-Zentrums, Dr. Nathanial Peters, für die Unterstützung bei der Beschaffung der konfokalen Mikroskopie- und Weitfeldmikroskopiebilder. Wir danken auch der UW Flow Core Facility und dem Leiter der Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, für die technische Unterstützung und Unterstützung. Abschließend bedanken wir uns bei Hannah Blümke für die Unterstützung bei Illustration und Grafikdesign.
Die Finanzierung erfolgte durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35 HL139602-01. Wir danken auch dem NIH S10 Grant S10 OD016240 für die Instrumentenfinanzierung am W. M. Keck Center sowie dem NIH Grant 1S10OD024979-01A1 für die Instrumentenfinanzierung in der UW Flow Core Facility.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
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