Дифференцировка и характеристика остеокластов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Остеокласты (ОК) – это гемопоэтические ^1,2, универсальные типы клеток, которые обычно используются исследователями в таких областях, как исследования заболеваний костей ^3,4, исследования рака ^5,6, тканевая инженерия ^7,8 и исследования эндопротезов ^9,10. Тем не менее, дифференцировка ОК может быть сложной задачей, поскольку для создания функциональных ОК¹¹ необходимо слияние мононуклеарных предшественников в многоядерные КОКи. Для дифференцировки ОК необходимы несколько биологических факторов, таких как активатор рецептора NF-κB лиганда (RANKL) и колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF). Сообщалось, что М-КСФ оказывает положительное влияние на пролиферацию клеток, выживаемость клеток и экспрессию RANK ^12,13,14. С другой стороны, RANKL связывается с RANK, который активирует нисходящие сигнальные каскады, индуцирующие остеокластогенез. Активация опосредована рецептор-ассоциированным фактором TNF 6 (TRAF6), что приводит к деградации ядерного фактора усилителя гена полипептида каппа лайт в ингибиторе В-клеток, альфа (IκB-α), связывающем белке, связывающем димеры NF-kB^16,17. Таким образом, при деградации IκB-α высвобождаются димеры NF-kB, которые затем транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию транскрипционных факторов c-Fos и ядерного фактора активированных Т-клеток 1 (NFATc1). Это, в свою очередь, запускает транскрипцию множества белков, связанных с дифференцировкой ОК^15,18. Повышенная регуляция белков, таких как DC-Stamp и Atp6v0d2, опосредует межклеточное слияние предшественников OC, что приводит к образованию синцития 19,20,21.

Что касается первичных клеток человека, CD34⁺ и CD14⁺ PBMC в настоящее время являются наиболее широко используемыми типами клеток для дифференцировки в OC²². Однако этот подход ограничен гетерогенностью в популяции CD34⁺ клеток, взятых у доноров²³ , и их ограниченной расширяемостью. ИПСК человека представляют собой альтернативный источник КОК. Поскольку они могут распространяться^{неограниченное количество} раз, они обеспечивают возможность расширения и масштабирования производства OC. Это позволяет дифференцировать большое количество ОК, что облегчает исследования ОК.

Опубликовано несколько протоколов дифференцировки ИПСК в ОК 25,26,27. Весь процесс дифференцировки можно разделить на часть распространения ИПСК, часть мезодермальной и гемопоэтической дифференцировки и дифференцировку ОК. Распространение ИПСК до процесса дифференцировки позволяет увеличить производство ОК до дифференцировки. Существует несколько подходов к мезодермальной и гемопоэтической дифференцировке. Традиционно для дифференцировки гемопоэтических клеток используется формирование эмбриоидных телец (БЭ), но однослойные подходы представляют собой еще одну стратегию гемопоэтической дифференцировки, которая не требует индукции БЭ. Тем не менее, однослойные системы, по-видимому, нуждаются в дальнейшей оптимизации, поскольку мы и другие специалисты обнаружили, что подходы, основанные на ЭБ, более надежны для дифференциации ОС.

В данной статье мы опишем дифференциацию ОК от ИПСК человека с помощью протокола, основанного на ЭБ. Этот протокол был адаптирован из Rössler et ^al.26 и модифицирован для повышения надежности и обеспечения криоконсервации в процессе дифференцировки. Во-первых, мы собирали гемопоэтические клетки только один раз после 10 дней дифференцировки. Затем гемопоэтические клетки были криоконсервированы, чтобы обеспечить большую гибкость в процессе дифференцировки. Кроме того, мы увеличили плотность посева гемопоэтических клеток с 1 x 10⁵ до 2 x 10⁵ клеток/^см2 для дифференцировки ОК. Использовалась более современная среда без сыворотки ИПСК человека (hiPSC-SFM, см. таблицу материалов), а покрытие лунок было выполнено 200-300 мкг/мл экстракта базальной мембраны (см. таблицу материалов) вместо 0,1% желатина. Пенициллин/стрептомицин не добавляли в СМИ.

Протокол Rössler et ^al.26 был первоначально адаптирован из протокола iPSC в протокол дифференцировки макрофагов²⁸, который использует образование EB для гемопоэтической дифференцировки. Несмотря на то, что формирование БЭ в течение длительного времени использовалось исследователями для дифференцировки гемопоэтических веществ^29,30, в литературе было описано несколько методов индукции БЭ, таких как спонтанная агрегация, центрифугирование в планшете с круглым дном, культура висячих капель, культура в биореакторе, культура в конической трубке, медленно вращающийся боковой сосуд и культура геля из микроплесеней³¹. В этом протоколе используется центрифугирование диссоциированных ИПСК в планшете с круглым дном, чтобы приблизить отдельные клетки ИПСК друг к другу и обеспечить образование сферы (ЭБ), как описано ниже.