Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Dendritik dikenler, genellikle glutamaterjik sinapsların ^1,2 post-sinaptik bölgesini içeren dendritlerin çıkıntılarıdır. Dendritik dikenler, sinaptik plastisite alanında özellikle ilgi çekicidir. Sinaptik kuvvet değiştiğinde omurgalar sıklıkla değişir, uzun süreli sinaptik güçlenmede daha büyük ve daha güçlü hale gelir veya uzun süreli sinaptik depresyonda daha küçük ve daha zayıf hale gelir 3,4,5,6,7. Sinaptik plastisitenin ötesinde, dendritik dikenlerin profili yaşam boyu değişir. Erken gelişimde, bir dendritik omurga oluşumu ve büyümesi dönemi vardır, ardından kararlı bir duruma ulaşana kadar dendritik omurga budaması^{yapılır 8,9,10}. Yaşlanan beyinde omurga kaybı, beyin küçülmesine ve bilişsel gerilemeye eşlik eder¹¹. Ek olarak, birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluk anormal dendritik dikenler ile karakterizedir. Şizofreniden etkilenen bireylerde çoklu beyin bölgeleri, muhtemelen değişmiş sinaptik budamadan kaynaklanan daha az dendritik dikene sahiptir¹². Otizm spektrum bozuklukları ayrıca dendritik omurga patolojileri ile karakterizedir¹³. Dendritik omurga kaybı, hem Alzheimer hem de Parkinson hastalığının ayırt edici özelliğidir^14,15. Dendritik omurga özelliklerine ilişkin araştırmaları kapsayan çok çeşitli araştırma konuları göz önüne alındığında, doğru omurga ölçümü için teknikler büyük önem taşımaktadır.

Boyama, yani Golgi yöntemi veya boya dolgusu yoluyla nöronların etiketlenmesi veya floresan proteinlerin eksprese edilmesi, dendritik omurga görselleştirmesi için yaygın yöntemlerdir 16,17,18. Görselleştirildikten sonra, dikenler çeşitli ücretsiz ve ticari olarak temin edilebilen yazılım istemcileri ile analiz edilebilir. Analizin istenen çıktısı, hangi yazılımın en çok kullanılacağını belirlemede önemli bir faktördür. Fiji, dendritik omurga yoğunluğuna odaklanan sorular için uygun bir yazılım seçeneğidir. Bununla birlikte, bu teknik büyük ölçüde, önyargı potansiyelini ortaya çıkarabilecek zaman alıcı manuel saymaya dayanır. SpineJ gibi yeni eklentiler, otomatik nicelemeye izin vererek ayrıca daha doğru omurga boynu analizine olanak tanır¹⁹. Bu yaklaşımların bir dezavantajı, SpineJ iki boyutlu görüntü yığınlarıyla sınırlı olduğundan, omurga hacmini belirlemek için üç boyutlu bir analizin kaybıdır. Ek olarak, omurga alt tipi bilgisinin elde edilmesi bu süreçlerle zorlaşır. Dört baskın omurga alt tipi, ince, mantar, güdük ve filopodia, hepsi bireysel işlevleri çağrıştırır ve büyük ölçüde morfoloji²⁰ ile sınıflandırılır. İnce dikenler, uzun bir boyun ve tanımlanmış bir kafa ile karakterizedir²¹. Mantar dikenleri çok daha büyük ve belirgin bir omurga kafasına^{sahiptir 22}. Güdük omurgalar kısadır ve baş ile boyun arasında çok az fark vardır²³. Filopodia, uzun, ince boyunlu ve açıkça gözlemlenebilir bir başı olmayan olgunlaşmamış dikenlerdir²⁴. Sınıflandırma değerli bilgiler sağlarken, dikenler bir boyut sürekliliği üzerinde bulunur. Kategorilere ayırma, morfolojik ölçüm aralıklarına^{dayanmaktadır 25,26}. Sınıflandırma için omurgaların manuel olarak ölçülmesi, bu yaklaşımdaki araştırmacılar için lojistik yükü artırır.

Özellikle üç boyutlu dendritik omurga analizine odaklanan diğer yazılım seçenekleri, omurga hacmi ve alt tip özellikleri 27,28,29,30,31 ile ilgili araştırmalar için daha uygundur. Zayıf z-düzlemi çözünürlüğü ve smear gibi üç boyutlu analizin sunduğu zorluğa rağmen, bu yazılım seçenekleri, dendritlerin ve dendritik dikenlerin kullanıcı güdümlü yarı otomatik bir şekilde güvenilir üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına izin verir. Tanımlanan omurgaların alt tiplerine göre otomatik olarak sınıflandırılması da bu omurga analizi yazılım paketlerinin bazılarında bulunan bir özelliktir. Bu, potansiyel iş yükü ve deneysel önyargı endişelerini iyileştirebilir. Neurolucida 360, güvenilir ve tekrarlanabilir üç boyutlu dendritik omurga tanımlaması ve sınıflandırmasına olanak tanıyan, ticari olarak temin edilebilen bir yazılımdır³². Burada, bu yazılımı kullanarak sabit dokuyu etkili bir şekilde hazırlamak, görüntüler elde etmek ve nihayetinde dendritik dikenleri ölçmek ve sınıflandırmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.