Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

Le chinasi RAF (ARAF, BRAF e CRAF) sono gli effettori diretti delle GTPasi RAS e i membri iniziatori della cascata chinasica RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-sopravvivenza. Studi recenti hanno dimostrato che l’espressione di CRAF svolge un ruolo chiave nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS, tra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule e l’adenocarcinoma duttale pancreatico 1,2,3,4,5. Inoltre, le mutazioni germinali della CRAF causano una forma particolarmente grave di RASopathy, la sindrome di Noonan ^6,7. Comprendere la regolazione del CRAF è fondamentale per lo sviluppo di approcci terapeutici di successo che mirino alla sua funzione nelle cellule.

Tutte le chinasi RAF possono essere suddivise in due domini funzionali, un dominio catalitico C-terminale (CAT) e un dominio regolatorio N-terminale (REG), che ne controlla l’attività (Figura 1A)⁸. Il dominio REG comprende il dominio di legame RAS (RBD), il dominio ricco di cisteina (CRD) e una regione ricca di serina/treonina (S/T-rich). In particolare, la regione ricca di S/T contiene il sito N’, che si lega a 14-3-3 in modo dipendente dalla fosforilazione (S259 in CRAF; Figura 1A) ⁸. Il dominio CAT comprende il dominio chinasi, insieme a un secondo sito di docking 14-3-3 ad alta affinità, denominato sito C’ (S621 in CRAF; Figura 1A) ⁸. Il legame differenziale delle proteine dimeriche 14-3-3 ai siti N’ e C’, insieme alla CRD, svolge un ruolo critico sia nell’attivazione che nell’inibizione di RAF 9,10,11,12,13. In condizioni normali di segnalazione, l’attivazione di RAF è avviata dal suo reclutamento nella membrana plasmatica da parte di RAS, permettendogli di formare dimeri attivi, di cui l’eterodimero BRAF-CRAF è la forma attiva predominante^14,15. I saggi biochimici con BRAF e CRAF, insieme alle strutture di microscopia elettronica criogenica (Cryo-EM) di BRAF dimerico, indicano che un dimero 14-3-3 stabilizza i dimeri attivi di RAF legandosi simultaneamente al sito C’ di entrambi i protomeri RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Al contrario, gli studi hanno dimostrato che in condizioni di quiescenza, RAF adotta una conferma citosolica, autoinibita, in cui il dominio REG si lega al dominio CAT e ne inibisce l’attività 12,18,19,20. Questo stato chiuso è stabilizzato da un dimero 14-3-3 legato al sito CRD e N’ nel dominio REG e al sito C’ nel dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. In BRAF, questo modello è supportato da recenti strutture Cryo-EM di monomeri BRAF autoinibiti e dai nostri precedenti studi biochimici 10,12,13,21,22. Tuttavia, mentre è dimostrato che 14-3-3 svolge un ruolo inibitorio nella regolazione di CRAF²³, uno stato autoinibito simile a BRAF può svolgere un ruolo minore nella regolazione di CRAF¹²; pertanto sono necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi con cui le proteine 14-3-3 regolano l’attività di CRAF. La regolazione mediata da 14-3-3 delle chinasi RAF richiede una pletora di eventi di fosforilazione e de-fosforilazione di RAF, il legame con varie proteine regolatorie e le interazioni con la membrana plasmatica⁸. Pertanto, è fondamentale che le interazioni 14-3-3-RAF siano misurate in condizioni fisiologicamente rilevanti e in presenza di un doppio strato lipidico intatto.

Per risolvere questo problema, è stata utilizzata la tecnologia NanoBRET (d’ora in poi denominata N-BRET; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli del kit) per sviluppare un test basato sulla prossimità per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive (Figura 1C). Questo sistema basato su BRET misura le interazioni di due proteine di interesse (POI), in cui una proteina è marcata con un donatore di nanoluciferasi (Nano) e l’altra con un tag Halo, per la marcatura con il ligando accettore di energia Halo618^22,24. L’interazione delle proteine di interesse si traduce nel trasferimento di energia da donatore a accettore, che a sua volta genera il segnale BRET (Figura 1C). La proteina donatrice Nano estremamente brillante (emissione (em) 460 nm) e il ligando Halo618 (em 618 nm) forniscono una maggiore separazione spettrale e sensibilità rispetto al BRET convenzionale, rendendola una piattaforma ideale per studiare le interazioni più deboli e rilevare sottili cambiamenti nel legame²⁴. Infatti, abbiamo precedentemente sviluppato un test basato su N-BRET per misurare le interazioni autoinibitorie dei domini RAF REG e CAT, che è stato essenziale per la caratterizzazione di un pannello di mutazioni di RASopathy nella CRD di BRAF e ha dimostrato l’importanza critica di questo dominio per mantenere l’autoinibizione e prevenire l’attivazione costitutiva di BRAF¹².

Il test qui descritto misura le interazioni tra CRAF, fuso con un tag Nano N-terminale (Nano-CRAF), e l’isoforma zeta di 14-3-3 fusa con il tag Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Dimostriamo che le interazioni di Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generano un robusto segnale BRET, che a sua volta può essere interrotto da mutazioni che impediscono il legame di 14-3-3 al sito N’ (S259A) e/o al sito C’ (S621A). Il seguente protocollo fornisce passaggi dettagliati per l’esecuzione, l’ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di questo test.