감자의 단일 및 결합 스트레스에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위한 고처리량 이미지 기반 표현형 분석

1. 식물 재료 준비 및 성장 조건 체외 감자(Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta)는 조직 배양액에서 절단하여 250mL 냄비에 이식합니다. 화분에 완전히 포화된 Klasmman Substrate 2를 채우고 1주일 동안 저조도 조건에서 성장 챔버에 보관합니다. 광도계를 사용하여 백색광 160%와 적외선 25%를 조합하여 캐노피 레벨의 조명 조건을 160μmol·m-2·s-35 로 조정합니다. 토양에서 시험관 절단을 성장시킨 지 10 일 후에 식물을 3L 화분 (직경 15.5cm, 높이 20.5cm)에 이식하십시오. 3L 냄비에 1850g의 3:1 Klasmann 기판 2: 모래를 채웁니다. 55 % 백색광과 81 % 적외선의 조합으로 320 μmol·m-2·s-1 의 조명 조건에서 식물을 성장 챔버에 놓고 긴 하루 체제 (16 시간 광주기)로 설정합니다. 성장 챔버의 온도를 주간/야간의 경우 22°C/19°C로 설정하고 전체 실험에 대해 상대 습도(RH)를 55%로 설정합니다. 화분 무게를 60% 토양 상대 수분 함량(SRWC)으로 유지하여 성장과 수율30,31을 유지하는 데 적합한 제어 수준으로 유지합니다.참고: 이전 시험에 따르면 체적 수분 함량을 60% 이상으로 유지하면 토양 표면에 이끼가 자라는 것이 촉진되고 식물 질병의 위험이 높아집니다. 또한 이끼의 존재는 엽록소 형광 이미징에서 오해의 소지가 있는 양성 신호를 생성할 수 있으며, 이는 필터링하기 어렵습니다. 다음 방정식을 사용하십시오 : SRWC % = (FW-DW) / (TW-DW) × 100, 여기서 FW는 토양 신선 중량, TW는 터거 중량, DW는 건조 중량32입니다.3개의 서로 다른 Klasmman Substrate 2 혼합물 백에서 토양 샘플(100g)을 반복으로 선택하고 토양의 신선 중량을 계량합니다. 화분에 물이 떨어지지 않고 물을 담을 때까지 토양을 물로 포화시키고 토양 터벅의 무게를 잰다. 토양 샘플이 완전히 건조될 때까지 샘플을 80°C의 오븐에 3일 동안 넣고 토양 건조 중량33의 무게를 잰다. 증발을 줄이기 위해 냄비 표면에 파란색 매트를 놓습니다.참고: 파란색은 이미지 분할에서 식물 픽셀에서 토양 배경을 빼는 데 필요합니다. 처리당 10개의 생물학적 복제를 선택합니다. 관개 중 화분을 무작위로 지정합니다(총 50개의 화분). 식물을 지지하고 표현형 시스템에 배치할 때 기계적 손상을 방지하기 위해 파란색 홀더를 추가합니다. 2. 스트레스 적용 초기 결절 단계( 시험관 절단을 이식한 후 28일)에서 식물을 5개의 처리 그룹으로 나누고 처리당 10개의 식물을 표현형화합니다(그림 1). 다음과 같이 단일 및 결합 된 스트레스를 해롭지 않은 수준으로 유도하십시오.성장 챔버에서 식물을 통제, 가뭄 및 침수 처리를 22 °C / 19 °C 주야간 (단계 1.7)으로 유지하며 SRWC의 비율이 다릅니다.전체 실험에 대해 60% SRWC를 사용한 대조군(C).20% SRWC가 있는 가뭄(D)은 7일 동안 서서히 진행한 후 1일 동안 회복합니다.5일 동안 160% SRWC로 침수(W)한 후 10일 동안 복구합니다. 침수 처리에서 토양 표면 위의 수위를 유지하려면 빈 냄비에 비닐 봉지를 넣은 다음 흙이 담긴 메인 냄비를 준비된 두 번째 냄비에 넣습니다. 식물을 30/28 °C 낮/밤 및 열처리를 위해 55 % RH의 성장 캡슐에 넣으십시오. 다음과 같이 단일 및 결합된 열 응력을 부과합니다.열(H)의 경우 30일 동안 SRWC의 60%로 28-15°C의 온도를 유지합니다. 열 + 가뭄 + 침수(HDW) 삼중 스트레스의 경우 처음 7일 동안은 30°C/28°C 낮/밤 온도에서 식물을 열처리하고(60% SRWC 유지) 나머지 7일 동안은 가뭄 + 열 결합 처리(20% SRWC 및 30°C/28°C)하고 마지막으로 식물을 1일 동안 침수 스트레스에 노출시킵니다. 후자의 경우 식물을 성장 챔버에 다시 넣고(조건은 1.7단계 참조) 1일 동안 160% SRWC로 침수를 유도합니다.참고: 유도 응력의 선택된 지속 시간은 처리된 식물의 100% 생존율로 해로운 영향 없이 응력 효과를 보여준 파일럿 실험을 기반으로 했습니다. 성장 챔버 환경에서 환경 조건의 변화는 온도의 경우 0.2°C, 습도의 경우 ±± 3% 범위였습니다. 3. 표현형을 위한 식물 준비 성장 챔버에서 오전 6:00에 조명을 켠 후 표현형 프로토콜 시작 전에 최소 2-3시간 동안 식물이 일정한 성장 조명 조건(320μmol·m-2·s-1)에 적응하도록 합니다. 이것은 광합성과 기공 조절이 안정된 상태에 있도록 보장한다34. 측정하기 전에 식물을 재배 위치에서 식물을 시스템에 수동으로 로드하는 데 사용되는 표현형 시스템의 성장 완충 영역으로 옮기고 자동 채점이 대기 모드에 있고 온실 내에 위치합니다(보충 그림 1, 보충 그림 2 및 보충 그림 3).참고: 식물은 3.5시간 지속되는 표현형 분석 기간 동안 성장 완충 영역에 유지되었습니다. 온실에서 환경 조건의 변화는 온도의 경우 ± 2 °C, 습도의 경우 ± 5 %, 광도의 변동 20 % 범위였습니다. 따라서 측정은 온실 조건이 식물에 미치는 영향을 피하면서 즉시 시작하고 짧아야 한다는 점을 고려하십시오. 표현형 분석 플랫폼에서, 섹션 4에 지정된 측정 프로토콜에 따라 주어진 간격으로 이미징 센서로 지정된 간격으로 컨베이어 벨트를 따라 자동으로 이동하는 디스크에 포트를 배치합니다. 각 공장/트레이에 고유 ID를 레이블을 지정하여 실험 전반에 걸쳐 측정된 데이터가 올바른 공장에 할당되도록 합니다. 4. 표현형 프로토콜 여러 이미징 센서(엽록소 형광, 열 IR, RGB 및 초분광 이미징)를 사용하여 표현형 분석 프로토콜을 최적화하여 식물의 생리학적 및 형태학적 매개변수를 동시에 측정할 수 있습니다(그림 2).참고: 식물 반응은 환경 조건과 일주 효과를 반영하기 때문에 화분의 무작위화를 고려하고 하루 중 같은 시간 내에 표현형을 수행하는 것이 중요합니다. 표현형 분석 플랫폼에서 식물이 적응 터널(그림 2A)을 통해 시스템에 들어가도록 하며, 여기서 식물의 높이를 먼저 캡처한 다음 고정된 작동 거리에 따라 각 센서의 높이를 조정합니다. 소프트웨어를 사용하여 측정 프로토콜에서 정당화된 대로 두 라운드로 측정을 수행합니다.첫 번째 라운드에서는 엽록소 형광 및 열화상 이미징을 사용하여 “빠른 반응”으로 정량화된 생리적 반응 측정으로 구성됩니다. 먼저 열 스트레스 처리에서 생리적 매개변수를 측정한 다음 나머지 처리를 측정합니다. 두 번째 라운드에서는 구조적 RGB 및 초분광 이미징을 포함하여 더 느린 반응을 평가하기 위한 다른 측정을 진행한 다음 중량 평가 및 물을 줍니다. 계량 및 급수 단계에서는 각 식물에 대한 기준 중량을 정의하여 주어진 처리에 대한 자동 급수 및 계량을 가능하게 합니다.총 기준 중량에 디스크, 컨베이어 벨트에 위치한 인서트, 지지대 파란색 홀더, 파란색 매트, 화분, 토양 및 정의된 프로토콜의 식물 바이오매스의 무게가 포함되는지 확인합니다. 계량 및 급수 단계에서 증발산을 정확하게 측정하려면 빈 냄비를 참조로 준비하십시오. 또한 식물 바이오매스 무게를 보정하기 위해 추가 화분을 준비하십시오. 50개의 식물을 측정하기 위해 전체 표현형 프로토콜 기간은 215분(1차 라운드 85분, 2차 라운드 130분)이 소요됩니다. 통제 조건 하에서 모든 식물을 매일 표현형(처리 1일 전)한 다음 스트레스 처리를 유도하여 동적 반응을 모니터링하고 유도된 스트레스의 초기 및 후기 단계를 평가합니다. 5. 각 이미징 센서의 설정 조정 Kinetic chlorophyll fluorescence imaging (키네틱 엽록소 형광 이미징)참고: 운동 엽록소 형광은 비생물적 스트레스를 포함한 다양한 환경 조건에 대한 식물의 광합성 능력을 조사하고 광화학 및 열 방출(비광화학 공정)의 양자 효율성에 대한 귀중한 정보를 제공하는 데 사용됩니다.짧은 광 프로토콜을 사용하여 빛에 적응한 식물에 대한 엽록소 형광 측정을 수행하여 다양한 처리 중인 식물의 반응을 구별합니다. 500 μmol·m-6500 μmol·m-2·s-1에서 시원하 백색 LED (6500 K)가 장착된 적응 터널의 빛 아래에서 5분 동안 식물을 순응합니다.참고: 엽록소 형광 이미징은 식물의 광합성 능력 변화를 모니터링하는 데 사용되는 광 적응 후 첫 번째 측정입니다. 식물 크기와 필요한 광도에 따라 사전 정의된 프로토콜을 선택하고 최적화합니다. 카메라 및 조명 강도 설정을 포함한 측정 설정을 최적화하여 최적의 신호 대 노이즈 비율로 강력한 신호를 획득할 수 있습니다.셔터(노출 시간, 측정 플래시 지속 시간) 및 감도(카메라의 전기 이득)와 같은 카메라 설정을 조정합니다. 셔터는 2ms, 감도는 12%로 사용합니다.참고: 이 값은 잎의 크기와 모양, 그리고 캐노피 상단과 이미징 센서 사이의 정의된 거리에 따라 조정됩니다. 광선 강도를 500μmol·m-2·s-1 로 조정하고 채도 펄스를 3200μmol·m-2·s-1로 설정하며, 이는 광선보다 6-7배 이상 높습니다. 광 정상 상태(Lss)(아래 설명 참조)에서 매개변수를 측정하려면 광 적응 터널에서 측정하기 5분 전에 광 적응 식물을 사용합니다. 광 적응 식물의 정상 상태 광시스템 II(PSII) 양자 수율을 추정하려면 짧은 광 프로토콜(그림 3)을 선택하고 프로토콜을 다음과 같이 설정하십시오.참고: 프로토콜 기간은 공장당 10초였습니다.500μmol·m-2·s-1 에서 3초 동안 냉백색 광선을 켜서 빛(F, t_Lss 일명 정상 상태 형광을 측정하여 측정을 시작합니다. Ft’) 3200 μmol·m-2·s-1 에서 800 ms 동안 포화 펄스를 적용하여 빛(Fm_Lss 일명 정상 상태 최대 형광을 측정합니다. Fm’) 광선을 끈 다음 원적색광(735nm)을 켜서 PSII가 800ms 동안 어둠 속에서 휴식을 취하고 빛의 정상 상태 최소 형광(Fo_Lss 일명 측정할 수 있도록 합니다. Fo’)입니다. 상대 매개변수를 계산하려면 배경을 빼고 관련 매개변수를 추출하는 데이터 분석기 소프트웨어를 사용합니다.참고: 사용된 프로토콜에서 추출된 매개변수는 다음과 같습니다: Fv/Fm_Lss aka로 결정된 광 정상 상태에서 광 적응 샘플의 PSII 광화학의 최대 효율성. Fv’/Fm’, 광계 II 양자 수율 또는 광 정상 상태에서 광계 II의 작동 효율은 QY_Lss aka로 정의됩니다. φPSII =F q’/Fm’이고 PSII(산화된 QA)에서 개방 반응 중심의 비율은 qL_Lss = (Fq’/Fv’) x (F0’/Ft’)로 결정됩니다. 열적외선(IR) 이미징참고: 열IR 이미징은 실제 캐노피 온도의 비침습적 측정에 사용되어 다양한 기공 규정을 결정합니다. 열화상 장치에서는 로봇 팔에 열화상 카메라를 측면으로 장착하여 측면에서 캐노피 온도를 측정합니다.이미지 처리 중 이미징된 물체의 온도에 대한 배경 온도의 대비를 높이려면 열화상 카메라의 반대쪽에 있는 자동 제어 가열 벽을 사용하여 대비를 높입니다. 이미징 장치의 공기 온도보다 8°C 높은 벽 온도를 조절합니다.참고: 열화상은 라인 스캔 모드35를 사용하여 어두운 곳에서 획득했습니다. 이미지 획득 후 RGB 측면 뷰 데이터를 기반으로 식물 마스크를 생성하고 이를 사용하여 이미지 분석에서 열 데이터와 공동 정합합니다. 이를 통해 스캔된 물체를 정확하게 식별할 수 있으며 식물 홀더와 같은 배경 간섭을 제거할 수 있습니다. 전체 실험에서 변동하는 환경 조건의 영향을 방지하려면 매개변수 온도 차이(델타 T 또는 ΔT)를 계산합니다.참고: Delta T(ΔT)는 잎 표면의 측정된 온도(식물의 전체 감지된 표면에서 모든 픽셀의 평균)와 이미징 상자 내부의 주변 공기 온도 간의 차이로 정의됩니다. RGB 이미징참고: RGB 이미징은 400-700nm의 가시 범위에서 빛을 감지하는 VIS(Visual Inertial System) 카메라를 기반으로 하며, 식물 형태, 구조 및 색상 인덱스 특징의 추출에 대한 심층 분석에 사용됩니다.이미징 장치에는 트레이의 정확한 위치를 지정하기 위한 회전 테이블이 포함되어 있으며 동시에 측면 보기를 위한 다각도 이미징이 가능합니다. 측면 이미징을 기반으로 RGB 이미징을 설정하여 라인 스캐닝 모드(RGB1)에서 촬영하고 스냅샷 모드(RGB2)에서 탑뷰 이미징을 촬영하는 세 가지 각도(0°, 120° 및 240°)에서 식물을 캡처합니다. 두 카메라 모두 LED 기반 광원을 갖추고 있어 이미징된 식물의 균일한 조명을 보장하여 형태학적 특징과 색상 특징을 정확하게 파악할 수 있습니다. 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 계산된 매개 변수를 추출합니다. 측면 및 상단 보기를 기반으로 한 추가 매개변수의 경우 식물 부피(디지털 바이오매스)36를 계산합니다. 상대 성장률(RGR)37 계산:여기서 Tn 및 Tn+1 은 시간 간격(일)을 나타냅니다. 초분광 이미징참고: 초분광 이미징은 식물의 스펙트럼 반사율을 시각화하는 데 사용됩니다. 잎 반사율의 변화는 주어진 식물의 다양한 생리적 상태를 나타내는 지표입니다.초분광 이미징 센서를 사용하여 380-900nm 범위의 가시광선-근적외선(VNIR) 초분광 카메라와 900-1700nm 범위의 단파장 적외선 카메라(SWIR)를 사용하여 광 스펙트럼의 가시 영역에서 캐노피 반사율을 정량화할 수 있습니다. 카메라는 할로겐 튜브 광원(600W)이 구현된 로봇 팔에 장착되어 XZ 영역을 가로질러 이동하는 이미지 획득 중에 균일하고 스펙트럼적으로 적절한 샘플 조명을 제공합니다. 두 카메라 모두 라인 스캔 모드에서 작동하며 빛이 차단된 이미징 박스에 배치됩니다. 각 측정 라운드 전에 스펙트럼 반사 테프론 표준을 사용하여 암전류 보정과 방사 보정의 두 가지 보정 측정(자동)을 수행합니다. 어두운 전류 노이즈를 제거하기 위해 원시 및 흰색 보정 이미지에서 어두운 보정 이미지를 뺍니다. 그런 다음, 뺀 후의 원시 이미지를 흰색 보정 이미지로 나누어 최종 초분광을 생성합니다. 6. 데이터 내보내기 및 이미지 분석 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 파이프라인의 자동 추출, 배경 빼기 및 식물 마스크 분할을 수행할 수 있습니다(그림 2B). 이 소프트웨어는 마스크 적용, 식물을 배경에서 격리하는 배경 빼기, 파라미터 계산이 RGB 이미징(38 ) 및 열화상이미지(20)에 대해 설명된 대로 처리되는 완전 자동화된 분석을 수행합니다. RGB 이미지로 생성된 Plant Mask 및 Tray Mask에 의해 정의된 대로 식물별 픽셀에서 측정 및 계산된 파라미터를 추출합니다. 이후 발달 단계에서 식생 녹색의 변화 또는 스트레스 처리의 영향으로 인해 발생할 수 있는 이미지가 완전히 선택되지 않은 경우 소프트웨어에서 로컬 데이터 분석 부분을 열고 각 센서에 따라 데이터 분석기 소프트웨어에서 식물 마스크 설정을 다시 조정합니다. 엽록소 형광 이미지 처리에서 엽록소 형광 식물 마스크 설정 분석 매개변수를 조정합니다(보충 그림 4).임계값을 True로 설정하면 플랜트 세분화가 자동으로 수행됩니다. Mask Frame Index를 False로 설정하는데, 이는 식물 마스크 감지를 위해 Time-Visual 프레임이 엽록소 형광 프로토콜에 정의된 대로 사용됨을 의미합니다. 열화상 처리에서 Plant Mask 분석을 위한 매개변수를 설정합니다(보충 그림 5).오브젝트 마스크 생성에 대한 자동 임계값을 False로 설정합니다. RGB 측면 이미지의 마스크를 True로 설정하여 분석에 사용합니다. RGB 이미지 처리에서 종과 발달 단계에 따라 식물 마스크 설정 분석 매개변수(보충 그림 6 및 보충 그림 7)를 조정합니다.오브젝트 마스크 생성에 대한 정의인 수식 4*G-3*B-R을 선택하고 사용되는 색상 구성 요소(빨강, 녹색, 파랑 구성 요소)를 정의합니다.참고: 이 표준 공식 및 기타 설정은 사용된 카메라 유형(상단 또는 크기 view), 적용된 처리 및 다양한 품종에 따라 변경될 수 있습니다. 향상된 녹색 채널이 있는 회색조 이미지를 식물이 덮는 표면을 결정하는 이진 이미지로 변환하는 데 사용되는 임계값 을 조정합니다. 노이즈와 유효하지 않은 픽셀을 줄이고 누락된 픽셀을 채우는 데 사용되는 Median Filter Size 를 조정합니다. 분석에 포함할 객체의 최소 크기 (픽셀)를 조정합니다. 마스크 개체 에 있는 구멍의 최소 크기를 픽셀(일반적으로 수십 픽셀) 단위로 조정합니다. 이 값보다 작은 구멍은 닫히고 개체 픽셀로 가져옵니다. 각 픽셀의 RGB 값을 정규화하기 위해 Use Reflection Reduction 을 True 로 설정합니다. 식물 마스크에서 노출 위/부족 노출 픽셀을 자르려면 Skip Bad Exposed Points 를 True 로 설정합니다(예: 표면 반사 누락 또는 노이즈가 신호보다 큰 어두운 픽셀). 색상 : 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 RGB에서 분석 한 분할 설정을 사용하여 응력 반응 및 식물 노화와 관련된 색상 변화에 대한 정보를 제공합니다.알림: 녹색도는 식물 발달의 모든 단계를 나타내는 사전 정의된 색상 범위를 사용하여 추정됩니다. 식물 표면에 해당하는 모든 픽셀의 색상 채널의 강도는 색상 분할을 위한 소스 색상 맵으로 사용하기 위해 그룹화되고 클러스터링되었습니다.처리된 RGB 이미지(배경 제거), 컬러 맵 – 특정 분석을 위한 색조 목록을 소프트웨어의 입력으로 제공합니다. 편향되지 않은 결과를 얻으려면 “훈련” 데이터 세트를 사용하여 색조 선택을 수행하고 다른 발달 단계와 치료를 선택하십시오.참고: 분석은 이 교육 데이터 세트에서 각 이미지의 각 픽셀에 대한 R, G 및 B 값을 저장합니다. 색상 정의 출력을 위해 소프트웨어를 사용하여 각 채널에 대해 0-255 범위의 색조 수(6가지 색조 선택)를 정의합니다. 데이터 분석기 소프트웨어(색상)에서 생성된 색조 목록을 제공합니다. 초분광 이미지 처리에서는 초분광 분석기 소프트웨어에 구현된 픽셀 단위 분석을 사용하여 수집된 초분광 데이터를 처리하며, 이는 방사 측정 및 다크 노이즈 보정, 배경 빼기, 식물 마스크 분할 기능을 제공합니다. 추가 분석을 위해 평균 스펙트럼 및 식생 지수를 사용합니다. VNIR 초분광 카메라로 촬영한 VNIR 영상에서 초분광 영상으로 데이터를 추출하기 위한 마스크를 만듭니다. SWIR 초분광 스캔의 경우 SWIR 분석을 기반으로 식물 마스크를 생성합니다.VNIR Plant Mask에서 공식 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556))을 사용하여 R이 특정 파장의 반사율 값을 나타내는 이미지를 시각화합니다(보충 그림 8). SWIR Plant Mask에서 이미지 시각화를 위해 이미지 처리에 (R960-R1450)-(R960-R1200) 공식을 사용합니다(보충 그림 9). 7. 무게를 달고 물을 주기 계량 및 급수 절차 동안 물을 주기 전(전)의 무게를 보관하십시오. 그런 다음 물을 주고 물을 준 후에도 무게를 유지하십시오. 참조 모드에서 트레이에 물 주기 – 각 트레이에는 데이터베이스에 저장된 참조 값이 있었으며 항상 물을 뿌렸습니다. 처리를 기반으로 참조를 결정합니다. 8. 데이터 분석 ANOVA 및 Shapiro 검정을 사용하여 데이터를 분석합니다. (dplyr), (tidyverse), (rstatix) 및 (ggpubr) 패키지를 사용하여 R 스튜디오(버전 4.2.3)에서 Pairwise Wilcox 테스트로 서로 다른 처리 간의 쌍별 비교를 수행합니다.참고: 이미지 분석은 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수행되었습니다. 이미지 획득에 대한 추가 분석을 위해 센서별 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하십시오.