Summary

התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Published: May 17, 2024
doi:

Summary

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

Abstract

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

Introduction

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודיהמעי 1. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7. כאן, אנו מספקים פרטים על שיטת מבחנה מדורגת וחזקה להשגת תרביות ENS מ- hPSCs. תרביות hPSC מדרגיות אלה פותחות אפיקים למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות וסינון תרופות בתפוקה גבוהה ויכולות לספק תאים להשתלה לרפואה רגנרטיבית.

שושלות נוירונים אנטריים נגזרות מתאי עצב (NC) העוקבים אחר נתיב ההתפתחות של ENS במהלך האמבריוגנזה. בעוברים, תאי NC מופיעים לאורך השוליים של הצלחת העצבית המתקפלת. הם מתרבים, נודדים ומולידים סוגי תאים רבים ושונים, כולל נוירונים חושיים, תאי Schwann, מלנוציטים, שלד גולגולתי ונוירונים אנטריים וגליה 8,9,10. ההחלטה על גורל התא תלויה באזור הנפרד לאורך הציר הקדמי-אחורי שממנו יוצאים תאי NC, כלומר NC גולגולתי, NC ווגאלי, גזע NC ו-NC סקרלי. ה-ENS מתפתח מתאי NC ואגליים וסקרליים כאשר הראשון שולט באוכלוסיית תאי העצב האנטריים בשל הנדידה הנרחבת לאורך המעי והתיישבות במעיים11.

גזירה של תאי NC מתאי PSC כרוכה בדרך כלל בשילוב של עיכוב SMAD כפול והפעלת מסלול WNT12,13. עד לאחרונה, כל פרוטוקולי האינדוקציה של NC כללו סרום ותוספים אחרים של מוצרים מן החי בתנאי התרבית. מדיה לא מוגדרת כימית לא רק מורידה את יכולת השחזור של אינדוקציה NC, אלא גם מאתגרת מחקרים התפתחותיים מכניסטיים. כדי להתגבר על אתגרים אלה, Barber et al14 פיתחו פרוטוקול אינדוקציה NC תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים כימית ולכן היה יתרון על פני שיטות חלופיות המסתמכות על גורמי החלפת סרום (למשל, KSR)13,14. זה הושג על ידי החלפת מדיה בסיסית ואופטימיזציה של פרוטוקול שהוצג במקור על ידי Fattahi et al כדי להפיק תאי NC אנטריים מ hPSCs. מערכת משופרת זו היא הבסיס לפרוטוקול הבידול hPSC המוצג כאן. זה מתחיל עם אינדוקציה של תאי עצב אנטרי (ENC) בתקופה של 15 יום על ידי אפנון מדויק של BMP, FGF, WNT ו TGFβ איתות בנוסף חומצה רטינואית (RA). לאחר מכן אנו גוזרים את שושלות ENS על ידי טיפול בתאים עם גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF). כל הרכבי המדיה מוגדרים כימית ומניבים תרביות עצביות אנטריות חזקות תוך 30-40 יום.

בנוסף למערכת תרבית התאים החד-שכבתית המתוארת כאן, פותחו גישות אינדוקציה חלופיות של NC המשתמשות בגופי עובר צפים חופשיים15,16. תאים נודדים בתרביות אלה הוכחו כמבטאים סמני NC עם תת-קבוצה המייצגת את NC הווגאלי. תרביות משותפות עם רקמת מעיים ראשונית שימשו להעשרת מבשרי NC אנטריים בתרבויות אלה. הרכבי המדיה במחקרים אלה מכילים שילוב של גורמים שונים כגון גורם גדילה עצבי, NT3 וגורם נוירוטרופי מוחי. בשלב זה, לא ברור לחלוטין כיצד גורמים אלה עשויים להשפיע על זהויות המחויבות של מבשר הנוירון האנטרית. להשוואה יעילה של השראת NC אנטרית בתרביות החד-שכבתיות ובתרביות מבוססות גוף עובר, נדרשים נתונים נוספים. בהתחשב בפריסות התרבות השונות באסטרטגיות אלה, יש לשקול את השימוש בכל שיטה ולייעל אותה בהתאם ליישום ספציפי בחשבון.

הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור ונבדק בהצלחה על ידינו ועל ידי אחרים באמצעות קווי hPSC שונים (מושרית ועוברית) 8,14,16.

Protocol

1. הכנת מדיה הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים. אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (2…

Representative Results

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של…

Discussion

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי מענקים מתוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך וקרן סנדלר, מענק March of Dimes מס’ 1-FY18-394 ו- 1DP2NS116769-01, פרס החדשנות החדשה של מנהל ה- NIH (DP2NS116769) ל- F.F. והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK121169) ל- F.F., H.M. נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של קרן לארי ל. הילבלום, מלגת NIH T32-DK007418 ותוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך מלגת פוסט-דוקטורט עצמאית.

Materials

Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) Gibco 12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex Gibco A14133-2
BMP4 R&D systems 314-BP
Cell culture centrifuge Eppendorf, model no. 5810R 02262501
Cell detachment solution, Accutase Stemcell Technologies 07920
CHIR99021 Tocris 4423
Conical tubes USA scientific 1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6 Life Technologies A1516401
DMEM/F-12 no glutamine Life Technologies 21331020
EDTA Corning MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit Life Technologies A2858501
FGF2 R&D systems 233-FB/CF
Fibronectin Corning 356008
GDNF Peprotech 450-10
Hemocytometer Hausser Scientific 1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC WiCell RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 Thermo Fisher Scientific Herralcell 150i
Inverted microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Laminar flow hood Thermo Fisher Scientific 1300 series class II, type A2
Laminin Cultrex 3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro Corning 25-015-CI
MEM NEAAs Corning 25-025-CI
Multiwell plates, Falcon BD 353934, 353075
N-2 Supplement CTS A1370701
Neurobasal Medium Life Technologies 21103049
PBS (Ca and Mg free) Life Technologies 10010023
Pipette filler Eppendorf Z768715-1EA
Pipette tips USA scientific 1111-2830
Pipettes Fisherbrand 13-678-11E, 13-678-11F
PO Sigma-Aldrich P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi ibidi 81156
RA Sigma-Aldrich R2625
SB431542 R&D systems 1614
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250-061
Ultra-low attachment plates Fisher Scientific 07-200-601
Y-27632 dihydrochloride R&D systems 1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

Play Video

Citer Cet Article
Majd, H., Richter, M. N., Samuel, R. M., Kalantari, A., Ramirez, J. T., Fattahi, F. Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66133, doi:10.3791/66133 (2024).

View Video