Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Gli stomi sono pori microscopici circondati da un paio di cellule di guardia sulla superficie delle foglie e di altre parti aeree delle piante. In ambienti in continua evoluzione, la regolazione dell’apertura stomatica è fondamentale per le piante per controllare l’assorbimento di anidride carbonica necessario per la fotosintesi a scapito della perdita d’acqua attraverso la traspirazione. Pertanto, la quantificazione dell’apertura stomatica è stata fondamentale per comprendere l’adattamento ambientale delle piante. Tuttavia, la quantificazione dell’apertura stomatica è intrinsecamente dispendiosa in termini di tempo e ingombrante in quanto richiede il lavoro umano per individuare e misurare i pori stomatici in un’immagine fogliare catturata da un microscopio. Per aggirare queste limitazioni, sono stati sviluppati vari metodi per facilitare la quantificazione dell’apertura stomatica in Arabidopsis thaliana, una pianta modello ampiamente utilizzata per studiare la biologia stomatica 1,2,3,4,5,6. Ad esempio, un porometro può essere utilizzato per misurare il tasso di traspirazione come metrica della conduttanza stomatica. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni dirette sul numero stomatico e sull’apertura che determinano la conduttanza stomatica. Alcuni studi hanno utilizzato tecniche di microscopia confocale che evidenziano i pori stomatici utilizzando un marcatore di actina fluorescente, un colorante fluorescente o l’autofluorescenza della parete cellulare 1,2,3,4,5. Sebbene questi approcci facilitino il rilevamento degli stomi, il costo sia del funzionamento di una struttura di microscopia confocale che della preparazione dei campioni di microscopia può essere un ostacolo all’applicazione di routine. In un lavoro pionieristico di Sai et al., è stato sviluppato un modello di rete neurale profonda per misurare automaticamente l’apertura stomatica da immagini microscopiche in campo chiaro di peeling epidermici di A. thaliana ⁶. Tuttavia, questa innovazione non esenta i ricercatori dal compito di preparare un peeling epidermico per l’osservazione microscopica. Recentemente, questo ostacolo è stato superato sviluppando un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia di A. thaliana, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning che misura automaticamente l’apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo⁷.

Gli stomi contribuiscono all’immunità innata delle piante contro i patogeni batterici. La chiave di questa risposta immunitaria è la chiusura stomatica che limita l’ingresso dei batteri attraverso il poro microscopico all’interno della foglia, dove i patogeni batterici proliferano e causano malattie⁸. La chiusura stomatica è indotta dal riconoscimento di pattern molecolari associati a microbi (MAMP), molecole immunogeniche spesso comuni a una classe di microbi, da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern localizzati sulla membrana plasmatica (PRR)⁹. Un epitopo di 22 amminoacidi della flagellina batterica noto come flg22 è un tipico MAMP che induce la chiusura stomatica attraverso il suo riconoscimento da parte del PRR FLS2¹⁰. Come contromisura, patogeni batterici come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (presa di forza) e Xanthomonas campestris pv. Le vesciche hanno sviluppato meccanismi di virulenza per riaprire gli stomi ^9,11,12. Queste risposte stomatiche ai patogeni batterici sono state convenzionalmente analizzate in saggi in cui le bucce epidermiche delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell’apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all’invasione batterica naturale che si verificano in una foglia attaccata alla pianta.

Qui, viene presentato un metodo semplice per studiare la chiusura e la riapertura stomatica durante l’invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l’interazione naturale pianta-batterio. Questo metodo sfrutta il dispositivo di imaging portatile per l’osservazione diretta degli stomi di A. thaliana su una foglia attaccata alla pianta inoculata con Pto, insieme alla pipeline di analisi delle immagini per la misurazione automatizzata dell’apertura stomatica.