Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.
Les protocoles de cristallisation robotisée des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de collecte de données in situ à température ambiante à partir de plaques de cristallisation à la ligne de lumière VMXi de la source de lumière Diamond sont décrits. Cette approche permet de déterminer facilement des structures cristallines de haute qualité à température ambiante à partir de plusieurs cristaux et fournit un retour d’information très rapide sur les résultats des essais de cristallisation ainsi que la cristallographie en série. La valeur des structures à température ambiante dans la compréhension de la structure des protéines, de la liaison au ligand et de la dynamique est de plus en plus reconnue dans la communauté de la biologie structurale. Ce pipeline est accessible aux utilisateurs du monde entier avec plusieurs modes d’accès disponibles. Les expériences de cristallisation mises en place peuvent être imagées et visualisées à distance avec des cristaux identifiés automatiquement à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique. Les données sont mesurées dans un système basé sur une file d’attente avec des ensembles de données de rotation allant jusqu’à 60° à partir de cristaux sélectionnés par l’utilisateur dans une plaque. Les données de tous les cristaux d’un puits ou d’un groupe d’échantillons particuliers sont automatiquement fusionnées à l’aide de xia2.multiplex, les sorties étant facilement accessibles via une interface de navigateur Web.
La cristallographie aux rayons X reste un outil clé pour comprendre la structure et la fonction des protéines, en fournissant des structures à haute résolution des protéines ou de leurs complexes avec, par exemple, des substrats ou des candidats médicaments. Dans de nombreux cas, cependant, l’obtention de cristaux aux propriétés souhaitables – très diffractants, forme cristalline susceptible d’être trempée et sans pathologies cristallines telles que le jumelage – reste un goulot d’étranglement considérable1. Comme les conditions chimiques appropriées pour produire des cristaux de protéines ne peuvent généralement pas être prédites, le criblage de cristallisation explorant des milliers de mélanges chimiques potentiels est standard, souvent aidé par l’automatisation/la robotique dans la mise en place d’écrans et d’hôtels à cristaux pour la surveillance, souvent à distance, des images de gouttes de cristallisation qui sont enregistrées.
Lorsque des cristaux apparaissent, ils doivent généralement être récoltés dans l’environnement de cristallisation à l’aide d’une boucle en nylon ou en Kapton, puis transférés dans une gouttelette contenant un agent de cryoprotection (dont la recherche est une variable supplémentaire) avant d’être plongés dans l’azote liquide. Ces étapes supplémentaires entre la cristallisation et la collecte de données radiographiques peuvent impliquer, entre autres facteurs, la déshydratation de la goutte de cristallisation lorsque son environnement scellé est rompu, des contraintes mécaniques sur le cristal lorsqu’il est manipulé et des dommages causés par les agents de cryoprotection au réseau cristallin (entraînant généralement une augmentation de la propagation de la mosaïque)2. De plus, la récolte des cristaux demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre et peut entraîner une inhomogénéité entre les échantillons, en particulier lorsque la peau se forme sur les gouttes pendant le processus de récolte. La ligne de lumière VMXi donne accès à des données utilisables à partir de cristaux collés à la plaque, qui seraient autrement rejetées pour la collecte de données.
La grande majorité des structures cristallines des rayons X sont déterminées à 100K à l’aide de l’approche ci-dessus, ce qui permet un transport et une manipulation simples des cristaux et augmente la durée de vie des cristaux dans le faisceau de rayons X de plusieurs ordres de grandeur. Cependant, on s’intéresse de plus en plus à la détermination des structures dans des conditions non cryogéniques, c’est-à-dire beaucoup plus proches des conditions physiologiques pertinentes pour la fonction protéique 2,3,4. Cela permet une bien meilleure appréciation de la structure dynamique des protéines, évite que les conformations ou les boucles d’acides aminés ne soient gelées dans des états fonctionnellement non pertinents5, et permet d’explorer la liaison au ligand dans des conditions beaucoup plus proches de celles de l’environnement naturel de la protéine au sein de la cellule et de l’organisme6.
Une autre approche, mise en œuvre sur la ligne de lumière VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ) du synchrotron Diamond Light Source, au Royaume-Uni, consiste à mesurer les données de diffraction directement à partir des cristaux dans l’environnement dans lequel ils se sont développés (c’est-à-dire à l’intérieur de la plaque de cristallisation), dans des conditions ambiantes et sans perturbation 7,8. Cela permet un retour d’information très rapide à partir des écrans de cristallisation et des optimisations pour guider un utilisateur vers une forme cristalline optimale pour ses besoins. Il permet également de produire de manière automatisée des structures à température ambiante de haute qualité9.
Ce protocole suppose qu’un utilisateur dispose d’un échantillon de protéine très pur prêt pour la cristallisation. Nous décrivons l’expérience de l’utilisateur accédant à l’installation de cristallisation de Harwell pour produire des cristaux de protéines, puis utiliser la ligne de lumière VMXi pour la collecte de données (Figure 1).
L’installation de cristallisation à Harwell
L’installation de cristallisation de Harwell (CF) est située dans le complexe de recherche de Harwell (RCaH) adjacent à la source de lumière Diamond. L’installation offre aux utilisateurs un laboratoire automatisé à haut débit pour la cristallisation macromoléculaire, utilisant la robotique pour le criblage de cristallisation, l’optimisation des cristaux, l’imagerie cristalline et la caractérisation. Grâce à une intégration étroite avec la ligne de lumière VMXi hautement automatisée, le rythme de détermination des structures à température ambiante s’est considérablement accéléré et permet la caractérisation de nouvelles structures protéiques, de complexes protéine-ligand et ADN-ligand, ainsi que le criblage automatisé de fragments (Figure 1), le tout dans des conditions non cryogéniques.
Le pipeline CF est constitué d’une suite d’instruments comprenant des robots de cristallisation nanolitres9 pour la cristallisation de protéines solubles et membranaires, des robots de manipulation de liquides pour préparer des cribles de cristallisation commerciaux et des cribles d’optimisation personnalisés complexes, et quatre instruments d’imagerie (un à 4 °C et trois à 20 °C pour l’imagerie des plaques de cristallisation (voir le tableau des matériaux). Un imageur est capable d’imager des plaques de verre en phase cubique lipidique (LCP) et un imageur est équipé d’optiques multi-fluorescence (toutes deux à 20 °C).
L’installation est maintenant largement utilisée par un large éventail d’utilisateurs universitaires et industriels, y compris le Laboratoire des protéines membranaires (MPL ; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), l’installation de criblage de fragments XChem 10, les lignes de lumière MX, le hub XFEL, ainsi que l’Institut Rosalind Franklin (RFI). Ce pipeline bien établi et optimisé a permis de réaliser des expériences de cristallisation dans un large éventail de projets de biologie structurale. Cet article décrit le pipeline de cristaux destinés à la collecte de données à VMXi, bien que les cristaux puissent également être récoltés et refroidis cryogéniquement ou dirigés vers le pipeline XChem.
L’accès des utilisateurs est attribué par le biais du système de proposition Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) et les utilisateurs industriels sont pris en charge par le groupe de liaison avec l’industrie du diamant. Tous les utilisateurs peuvent venir sur le site avec leur(s) échantillon(s) ou leur(s) plaque(s), qui peuvent être transportés à la main. Il n’est pas recommandé d’envoyer les plaques par coursier car notre expérience suggère que les gouttes peuvent s’éloigner de l’endroit où elles ont été distribuées, ou que les gouttes peuvent être endommagées par le réservoir de cristallisation. Alternativement, sur rendez-vous, les utilisateurs peuvent envoyer leurs échantillons de protéines aux FC, où les membres du personnel organisent des expériences de cristallisation en leur nom. Les expériences peuvent être surveillées à distance par l’utilisateur en se connectant à Rock Maker Web dans le cas de CF ou via ISPyB dans le cas de VMXi. L’accès au CF peut se faire de manière itérative sur la base des résultats de diffraction des rayons X recueillis à Diamond.
Ligne de faisceau VMXi à la source de lumière Diamond
La ligne de faisceau VMXi (ci-après dénommée « la ligne de faisceau ») est un instrument unique et récemment développé entièrement dédié à la cristallographie aux rayons X à température ambiante et hautement automatisée, en mettant l’accent sur la mesure des données des cristaux dans des plaques de cristallisation appropriées. La ligne de lumière offre un micro foyer (10 x 10 μm), un faisceau rose (passe-bandede <5 × 10-2 ΔE/E) avec un flux élevé de ~2 ×10 13 photons/s (à 16 KeV)7. Ce faisceau à haut flux, couplé à un détecteur rapide, permet un débit très élevé d’échantillons et la collecte de données à partir d’échantillons d’une taille supérieure à 10 μm.
Les plaques de cristallisation entrent dans la ligne de faisceau en étant stockées dans un système de stockage d’échantillons et imagées en fonction du calendrier fourni par l’utilisateur lors de l’enregistrement des plaques à l’aide de l’interface ISPyB11 SynchWeb12. En règle générale, il est conseillé aux utilisateurs de sélectionner une séquence de Fibonacci de points temporels pour l’imagerie (0, 12, 24, 36, 60… 7 320 h à partir de l’entrée de la plaque dans le système). L’utilisateur est informé par email dès qu’une plaque a été imagée. L’imagerie en lumière visible et en lumière UV est disponible pour les utilisateurs sur demande. Les images prises par le système de stockage d’échantillons sont analysées par un algorithme d’apprentissage automatique ; Cela permet de localiser et de définir automatiquement les points d’intérêt des objets qui ressemblent à des cristaux et d’enregistrer les points d’intérêt prêts à être ajoutés par l’utilisateur à une file d’attente pour la collecte de données. Les utilisateurs peuvent également cliquer manuellement sur les images de lumière visible pour enregistrer des points d’intérêt ou cliquer et faire glisser une région à analyser par balayage matriciel. Ces points sont disponibles pour les utilisateurs qui peuvent les ajouter à la file d’attente en même temps que les points localisés automatiquement.
Une fois que tous les échantillons ont des paramètres appropriés pour la collecte des données, la plaque entre dans une file d’attente. Lorsque la plaque atteint le haut de la file d’attente, elle est automatiquement distribuée à la ligne de faisceau. Les plaques de cristallisation sont chargées automatiquement à partir des hôtels de cristal dans la ligne de faisceau par un bras robotisé, et après l’appariement des images, des ensembles de données cristallographiques d’une rotation allant jusqu’à 60° sont mesurés à partir de chaque cristal sélectionné selon les instructions définies par l’utilisateur. Toutes les gouttes à l’intérieur d’une plaque peuvent être utilisées pour ces expériences sur la ligne de faisceau. Les données sont fusionnées à partir de plusieurs cristaux pour produire de manière automatisée des ensembles de données isomorphes et fusionnés de manière optimale 7,9. Une fois que tous les ensembles de données en file d’attente sont collectés, l’utilisateur reçoit un e-mail contenant un lien à suivre pour afficher les ensembles de données dans ISPyB11, comme dans les autres lignes de faisceaux Diamond MX. Les utilisateurs sont également dirigés vers la page Web de la ligne de faisceau (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).
Nous avons décrit la procédure complète depuis l’arrivée d’un échantillon de protéines dans le CF jusqu’au téléchargement des données finales par l’utilisateur pour d’autres applications. Les étapes critiques sont la production d’un échantillon de protéines de haute qualité et de cribles cristallins appropriés, soit à l’aide de cribles à matrice creuse commerciale, soit à l’aide de cribles d’optimisation basés sur des conditions établies. Ce processus peut avoir lieu dans les FC, ou les utilisateurs peuvent effectuer les procédures de cristallisation dans les laboratoires d’origine et apporter des plaques de cristallisation appropriées à la ligne de faisceau. L’identification de paramètres de collecte de données appropriés peut être importante pour certains échantillons, en particulier lorsque les dommages causés par les rayonnements sont préoccupants. Dans la plupart des cas, le traitement automatisé des données est tout à fait suffisant pour répondre à la question scientifique, bien que les utilisateurs conservent la possibilité de procéder à un retraitement à l’aide des outils de ligne de faisceau, par exemple, lorsque le groupe spatial est ambigu ou que seule la partie initiale des données collectées est utilisée pour minimiser les effets des dommages causés par les rayonnements.
Si des cristaux appropriés ne sont pas produits à partir des essais de cristallisation initiaux, des changements dans la concentration en protéines, la pureté ou les écrans de cristallisation peuvent être explorés, tout comme l’utilisation de l’ensemencement des cristaux. Si les cristaux ne se diffractent pas à une résolution utile à la ligne de faisceau, des balayages de grille peuvent être utilisés avec un faisceau non atténué pour évaluer la limite de diffraction inhérente et la cellule unitaire des cristaux afin de guider les efforts d’optimisation. Les cristaux qui sont trop petits pour la collecte de données à l’intérieur des plaques (par exemple, <10 μm) peuvent plutôt convenir à la cristallographie en série ou aux expériences de nanofocalisation (par exemple, à la ligne de faisceau Diamond VMXm). La résolution de structures à l’aide de données VMXi est généralement simple par remplacement moléculaire, en particulier depuis l’avènement d’Alphafold16 pour donner des modèles de recherche efficaces. Si cela ne réussit pas, les cristaux peuvent être récoltés et cryorefroidis à partir de plaques pour permettre des expériences conventionnelles de diffraction anormale à une seule longueur d’onde, de diffraction anormale à plusieurs longueurs d’onde ou de phase à grande longueur d’onde.
Les avantages de cette méthode incluent la possibilité d’obtenir des ensembles de données rapides et de haute qualité et un retour d’information directement à partir des plaques de cristallisation sans avoir besoin de perturber les cristaux des environnements dans lesquels ils se sont développés. Ce que l’on appelle la « renaissance à température ambiante » en biologie structurale privilégie les structures obtenues dans des conditions non cryogéniques pour permettre d’explorer davantage la pertinence physiologique et la dynamique des protéines2. Habituellement, une résolution légèrement inférieure est obtenue par rapport à un cristal cryorefroidi optimisé, mais seulement lorsque des conditions cryogéniques appropriées ont été établies et si les cristaux sont robustes à la manipulation mécanique et à l’ouverture de la goutte de cristallisation3. Une application à venir pour laquelle ce pipeline est très bien adapté est le criblage à grande échelle de complexes protéine-ligand ou de campagnes de fragments à température ambiante dans la découverte de médicaments. Les ligands ou les fragments peuvent être cocristallisés ou ajoutés par pipette ou par éjection de gouttes acoustiques avant la collecte de données à température ambiante. Une autre application consiste à mesurer rapidement les données de plusieurs centaines ou milliers de cristaux de manière très efficace, puis à utiliser le logiciel DIALS17 multiplex14 pour extraire des amas isomorphes qui peuvent représenter différentes entités biologiques ou pour établir des différences statistiquement significatives entre des populations de cristaux qui ont été traités d’une manière différente ou exposés à des ligands ou des signaux différents.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les nombreux scientifiques de Diamond Light Source et les membres de l’équipe de soutien qui ont contribué à la conception, à la construction et à l’exploitation de la ligne de lumière VMXi. Nous sommes reconnaissants envers les utilisateurs de la ligne de faisceau, qui ont apporté des idées plus tard au développement des pipelines de cristallisation et de collecte de données. L’installation de cristallisation de Harwell est soutenue par Diamond Light Source Ltd, l’Institut Rosalind Franklin et le Conseil de recherches médicales.
Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request |
Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 |
Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |