Imaging vitale og ikke-vitale hjernen pericytter i hjernen skiver etter subaraknoid blødning
Summary
Den foreløpige undersøkelsen bekrefter at subaraknoidalblødning (SAH) forårsaker hjernepericyttdød. Evaluering av pericytkontraktilitet post-SAH krever differensiering mellom levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter. Derfor er det utviklet en prosedyre for å merke levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter samtidig i hjerneseksjoner, noe som letter observasjon ved hjelp av et høyoppløselig konfokalmikroskop.
Abstract
Pericytter er viktige veggmalericeller som ligger i cerebral mikrosirkulasjon, sentrale i aktivt modulerende cerebral blodstrøm via kontraktilitetsjusteringer. Konvensjonelt måles deres kontraktilitet ved å observere morfologiske skift og nærliggende kapillærdiameterendringer under spesifikke omstendigheter. Likevel blir post-vevsfiksering, evaluering av vitalitet og påfølgende pericytkontraktilitet av avbildede hjernepericytter kompromittert. På samme måte kommer genetisk merking av hjernepericytter til kort når det gjelder å skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige pericytter, spesielt i nevrologiske forhold som subaraknoidalblødning (SAH), hvor vår foreløpige undersøkelse validerer hjernens pericyttdød. En pålitelig protokoll er utviklet for å overvinne disse begrensningene, noe som muliggjør samtidig fluorescerende merking av både funksjonelle og ikke-funksjonelle hjernepericytter i hjerneseksjoner. Denne merkingsmetoden tillater høyoppløselig konfokalmikroskopvisualisering, samtidig som den markerer hjernesnittmikrovaskulaturen. Denne innovative protokollen gir et middel til å vurdere hjernens pericytkontraktilitet, dens innvirkning på kapillærdiameter og pericytstruktur. Undersøkelse av hjernens pericytkontraktilitet innenfor SAH-konteksten gir innsiktsfull forståelse av dens effekter på cerebral mikrosirkulasjon.
Introduction
Hjernepericytter, preget av deres slanke fremspring og utstående cellelegemer, omkranser mikrosirkulasjonen 1,2. Mens cerebral blodstrømforstørrelse hovedsakelig drives av kapillær dilatasjon, viser mindre arterier langsommere utvidelseshastigheter3. Pericytkontraktilitet påvirker kapillærdiameter og pericytmorfologi, noe som påvirker vaskulær dynamikk4. Sammentrekning av hjernens pericytter fører til kapillær innsnevring, og i patologiske scenarier kan overdreven sammentrekning hindre erytrocytstrømmen5. Ulike faktorer, inkludert noradrenalin frigjort fra locus coeruleus, kan indusere hjernens pericyttkontraksjon i kapillærene6. Med en regulatorisk rolle i cerebral blodstrøm utviser pericytter 20-HETE syntese, som fungerer som en oksygensensor under hyperoksi7. Oksidativ-nitrativ stressutløst sammentrekning av hjernepericytter påvirker kapillærene negativt5. Til tross for både in vivo og ex vivo undersøkelser av hjernepericyttkontraksjon8, fortsetter begrenset kunnskap om avbildning av levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver.
Avgjørende er at post-vevsfikseringsavbildning av hjernepericytter kompromitterer deres vitalitet og påfølgende kontraktilitetsvurdering. Videre, i scenarier som nevrologiske lidelser (f.eks. Subaraknoidalblødning – SAH), klarer ikke transgen merking av hjernepericytter å skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige pericytter, som bekreftet av vår foreløpige SAH-induserte hjernepericyttdødsstudie9.
For å overvinne disse utfordringene brukte vi TO-PRO-3 for å merke levende pericytter, mens avdøde ble farget med propidiumjodid (PI). Vi brukte høyoppløselige konfokale bildebehandlingsteknologier for å visualisere levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver samtidig som vi bevarte skiveaktivitet under avbildning. Denne artikkelen tar sikte på å presentere en reproduserbar metode for avbildning av levedyktige og ikke-levedyktige hjernepericytter i hjerneskiver, som tjener som et verdifullt verktøy for å undersøke virkningen av hjernepericytter på cerebral mikrosirkulasjon etter SAH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklet er høyoppløselige konfokale bildebehandlingsteknikker for å visualisere vitale hjernepericytter, ikke-vitale hjernepericytter og mikrovaskulaturen i hjerneskiver. I akutte hjerneskiver hos rotter innebærer prosessen innledende merking av pericytter med TO-PRO-311, etterfulgt av mikrovaskulære endotelceller med IB412; Deretter utføres identifisering av avdøde pericytter ved bruk av PI. Denne protokollen er enkel, reproduserbar og svært anvendelig for funksjo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Natural Science Foundation i Yunnan-provinsen (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
