Imagem de Pericitos Cerebrais Vitais e Não Vitais em Fatias Cerebrais após Hemorragia Subaracnóidea
Summary
A investigação preliminar confirma que a hemorragia subaracnóidea (HSA) causa a morte do pericito cerebral. A avaliação da contratilidade dos pericitos pós-HAS requer diferenciação entre pericitos cerebrais viáveis e não viáveis. Assim, um procedimento foi desenvolvido para marcar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis simultaneamente em cortes cerebrais, facilitando a observação usando um microscópio confocal de alta resolução.
Abstract
Os pericitos são células murais cruciais situadas dentro da microcirculação cerebral, fundamentais na modulação ativa do fluxo sanguíneo cerebral através de ajustes de contratilidade. Convencionalmente, sua contratilidade é aferida observando-se deslocamentos morfológicos e alterações no diâmetro capilar próximo em circunstâncias específicas. No entanto, a fixação pós-tecidual, avaliando a vitalidade e a consequente contratilidade dos pericitos cerebrais imageados, fica comprometida. Da mesma forma, a marcação genética de pericitos cerebrais é insuficiente na distinção entre pericitos viáveis e não viáveis, particularmente em condições neurológicas como hemorragia subaracnóidea (HSA), onde nossa investigação preliminar valida a morte de pericitos cerebrais. Um protocolo confiável foi desenvolvido para superar essas restrições, permitindo a marcação fluorescente simultânea de pericitos cerebrais funcionais e não funcionais em seções cerebrais. Este método de marcação permite a visualização em microscópio confocal de alta resolução, marcando concomitantemente a microvasculatura do corte cerebral. Este protocolo inovador oferece um meio de avaliar a contratilidade do pericito cerebral, seu impacto no diâmetro capilar e na estrutura do pericito. A investigação da contratilidade dos pericitos cerebrais no contexto da HAS permite uma compreensão perspicaz de seus efeitos na microcirculação cerebral.
Introduction
Os pericitos cerebrais, que se distinguem por suas protuberâncias delgadas e corpos celulares salientes, circundam a microcirculação 1,2. Enquanto o aumento do fluxo sanguíneo cerebral é predominantemente impulsionado pela dilatação capilar, as artérias menores exibem taxas de dilatação mais lentas3. A contratilidade dos perócitos exerce influência sobre o diâmetro capilar e a morfologia dos pericitos, afetando a dinâmica vascular4. A contração dos pericitos cerebrais leva à constrição capilar e, em cenários patológicos, a contração excessiva pode impedir o fluxo eritrocitário5. Vários fatores, incluindo a noradrenalina liberada do locus coeruleus, podem induzir a contração do pericícito cerebral dentro dos capilares6. Com papel regulador no fluxo sanguíneo cerebral, os pericitos exibem síntese de 20-TETE, servindo como sensor de oxigênio durante a hiperóxia7. A contração dos pericitos cerebrais desencadeada pelo estresse oxidativo-nitrativo afeta negativamente os capilares5. Apesar das investigações de vivo e ex vivo sobre a contração do pericito cerebral8, persiste um conhecimento limitado sobre a obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em fatias cerebrais.
Crucialmente, a imagem pós-fixação tecidual dos pericitos cerebrais compromete sua vitalidade e subsequente avaliação da contratilidade. Além disso, em cenários como distúrbios neurológicos (por exemplo, hemorragia subaracnóidea – HSA), a marcação transgênica de pericitos cerebrais falha em diferenciar entre pericitos viáveis e não viáveis, como confirmado por nosso estudo preliminar de morte cerebral induzida porHAS9.
Para superar esses desafios, empregamos o TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, enquanto os falecidos foram corados com iodeto de propídio (PI). Usamos tecnologias de imagem confocal de alta resolução para visualizar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, preservando a atividade de cortes durante exames de imagem. Este artigo tem como objetivo apresentar um método reprodutível para obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, servindo como uma ferramenta valiosa para investigar o impacto dos pericitos cerebrais na microcirculação cerebral pós-HAS.
Protocol
Representative Results
Discussion
São desenvolvidas técnicas de imagem confocal de alta resolução para visualização de pericitos cerebrais vitais, pericitos cerebrais não vitais e microvasculatura em fatias cerebrais. Em cortes agudos de cérebro de ratos, o processo envolve a marcação inicial dos pericitos com TO-PRO-311, seguida por células endoteliais microvasculares com IB412; posteriormente, a identificação dos pericitos falecidos é realizada por meio do IP. Este protocolo é simples, repr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81960226,81760223); Fundação de Ciências Naturais da Província de Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
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