초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.
골격근은 힘을 생성하고 신체 움직임을 가능하게 하는 많은 묶인 근섬유로 구성된 큰 세포융합체입니다. 초파리 는 근육 생물학을 연구하는 고전적인 모델입니다. 초파리 유전학과 고급 오믹스 접근법의 조합은 근육 형태 형성 및 재생을 조절하는 주요 보존 분자의 식별로 이어졌습니다. 그러나, 이들 분자의 전사 역학과 세포융합체 내 메신저 RNA의 공간적 분포는 기존의 방법으로 평가할 수 없습니다. 여기서는 기존의 단일 분자 RNA 형광 in situ hybridization(smFISH) 방법을 최적화하여 성인 비행 근육과 근육 줄기 세포 내에서 개별 mRNA 분자를 검출하고 정량화할 수 있도록 했습니다. 개념 증명(PoC)으로 두 가지 진화적 보존 전사 인자인 Mef2 및 Zfh1/Zeb의 mRNA 발현 및 분포를 분석했습니다. 우리는 이 방법이 근육 전구체 세포, 성인 근육 및 근육 줄기 세포의 두 전사체 모두에 대해 단일 mRNA 분자를 효율적으로 검출하고 정량화할 수 있음을 보여줍니다.
성인 골격근은 수축 특성이 움직임을 생성하는 분화된 다핵 근섬유로 구성되어 있습니다. 근육 성장, 유지 및 재생은 배아 발달 중에 지정된 근육 전구 세포와 근육 줄기 세포(MuSC)에 의존합니다1. 근육 생성 프로그램은 일련의 핵심 근육 전사 인자(TF)(예: Pax3/7, MYOD, Mef2 및 ZEB)2,3,4에 의해 미세하게 제어됩니다. 근육 생물학을 조절하는 분자 메커니즘을 해독하는 것은 근본적인 근육학 관련 질문을 해명하고 근육 퇴행성 질환을 치료하는 데 사용할 수 있는 치료법을 찾는 데 중요합니다.
초파리는 근형성을 연구하기 위한 유전적 모델로서 오랜 역사를 가지고있다 5. 최근 근육 재생 6,7,8을 조사하는 새로운 모델로 등장했습니다. 근육 구조와 핵심 근육 생성 프로그램은 파리와 포유류 사이에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 예를 들어, TF Mef2 및 Zfh1/ZEB는 근육 발달 및 재생을 조절하는 보존 기능을 가지고있습니다 3,9,10,11. 간접 비행 근육(Indirect Flight Muscles, IFM)과 같은 성체 초파리 근육(Adult Drosophila muscle)은 성체 근육 전구 근육(Adult Muscle Progenitors, AMP)으로 알려진 MuSC의 특정 집단으로 형성됩니다12. 이러한 AMP는 배아 발생 중에 지정되며 날개 및 다리 디스크와 같은 상피 구조와 관련이 있습니다. 배아 및 유충 단계에 걸쳐, AMP는 IFM을 형성하기 위해 분화 및 융합에 관여할 때 변태될 때까지 미분화 상태로 남아 있습니다13,14. TF Spalt major(spalt, salm)는 비행 근육 발달 중에 발현되며 구조적 정체성을 결정하는 데 필요하다15. Mef2는 성인 근육 형성에 필수적인 또 다른 중요한 근육 생성 TF입니다16,17. 이는 AMP에서 발현되고 성인 IFM(10,18)에서 유지됩니다. 대부분의 AMP는 기능적 근육으로 분화하지만, 부분집합은 분화를 벗어나 성인 MuSC를 형성한다11. 척추동물과 유사하게, TF Zfh1/ZEB는 성체 MuSC의 조기 분화를 방지하고 줄기 9,10을 유지하는 데 필요합니다.
유전자 발현 역동성은 각종 근육 생물학 과정19,20를 통제하기 위하여 입증되었다. 고처리량 단일 세포 및 단일 핵 RNA 시퀀싱 기술의 출현으로 이러한 전사 역학21,22에 대한 포괄적인 탐구가 가능해졌습니다. 이러한 접근법의 한 가지 주목할 만한 한계는 다핵 근육 섬유에서 mRNA 분자의 공간적 분포를 제공할 수 없다는 것입니다. 이러한 특징은 두 가지 유형의 mRNA 바디를 나타내는 단일 분자 형광 현장 교잡화(smFISH)로 조사할 수 있습니다: 1. 세포질에 퍼져 있고 성숙한 RNA를 나타내는 개별 mRNA 분자 및 2. 최대 2개의 밝은 핵 병소는 초기 전사체에 해당하며 전사 활성 대립유전자23을 나타냅니다. 따라서 smFISH는 개별 mRNA 분자 정량화를 위해 선택되는 방법으로, 공간 분포를 조사하고 유전자 전사 역학의 스냅샷을 제공합니다.
smFISH 분석법은 표적 전사체를 보완하도록 특별히 설계된 짧은 형광 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 의존합니다. 어닐링 시 공초점 현미경24을 사용하여 단일 분자 수준에서 mRNA를 검출할 수 있는 고강도 점 광원을 생성합니다. 이 방법은 포유류 근육 조직(19,20)을 포함한 다양한 세포 유형에 점점 더 많이 적용되고 있다. 그러나 다른 동물 모델과 마찬가지로 초파리에서 성인 근육 유전자 발현에 대한 대부분의 지식은 mRNA 분자의 공간적 위치에 대한 정량적 정보가 부족한 벌크 분자 분석에서 파생됩니다. 여기서 우리는 근육 전구체 세포와 성인 초파리 근육23,25에서 smFISH를 수행하는 방법을 최적화했습니다. 이 프로토콜에는 핵 분할과 mRNA 계수 및 국소화를 위한 완전 자동화된 분석 파이프라인이 포함되어 있습니다.
smFISH 방법의 적용은 최근 인기를 얻었으며 다양한 세포 유형 및 모델 유기체로 사용이 확장되었습니다. 그러나 초파리의 경우 성인 근육 유전자 발현에 대한 대부분의 지식은 mRNA 분자의 정확한 공간 위치에 대한 정량적 정보를 제공하지 못하는 벌크 분자 분석에서 파생됩니다. 이 간극을 해결하기 위해 근육 전구체 세포와 성체 초파리 근육에서 smFISH를 수행하는 방법을 최적화했습니다. 이 접근법은 이전에 발표된 프로토콜23 에서 채택되었으며 초파리 근육 조직에 최적화되었습니다.
고품질 smFISH 이미지를 얻는 데 있어 가장 큰 장애물은 성인 근육의 두께로, 프로브의 최적 침투를 방해합니다. 따라서 성체 근육을 동물의 다른 조직과 분리하고 가벼운 교반으로 교잡 과정을 수행하는 것이 중요합니다. 이 특정 단계는 조직의 효과적인 투과를 보장합니다.
또 다른 중요한 측면은 신호 대 잡음비로 인해 계산 파이프라인이 특정 mRNA 스폿을 검출하지 못할 수 있다는 것입니다. 신호 대 잡음비를 높이는 것은 프로브의 최적 농도를 찾는 것으로 나타났습니다. 최적의 희석은 접합 염료 및 올리고뉴클레오티드 조성물을 포함한 각 프로브 세트의 조성에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 희석을 시도하는 것이 좋습니다. 200nM의 최종 희석은 이 실험에서 성인 조직에 대한 최상의 신호 대 잡음비를 산출했습니다.
smFISH 방법을 사용하면 TS 초점에서 새로 합성된 RNA의 수를 정량화할 수 있습니다. 유전자가 활발하게 전사되면 TS에서 여러 초기 RNA가 동시에 생성됩니다. 결과적으로, TS의 강도는 성숙한 세포질 RNA의 강도를 능가할 것이며, 이 특징은 핵 국소화와 결합되어 TS를 개별 세포질 RNA와 구별할 수 있습니다. 근육 생물학의 맥락에서 TS 검출 및 정량화는 동일한 syncytium 내의 근육 핵 간 특정 유전자의 전사 동기화를 결정하는 데 특히 중요합니다. 그러나 이 계산 파이프라인은 세포질 mRNA와 TS 신호를 구별하도록 설계되지 않았습니다. 대안으로 이 smFISH 분석법을 BayFISH 또는 FISH-quant29,30과 같은 잘 정립된 다른 smFISH 분석 도구와 결합하는 것이 좋습니다. 이러한 도구는 RNA 응집체의 자동 분할 및 형광 강도 계산을 매우 정밀하게 용이하게 하는 것으로 입증되었습니다.
마지막으로, smFISH는 높은 공간 분해능으로 mRNA 분자를 검출하지만, 동시에 적은 수의 mRNA를 분석하는 데 한계가 있습니다. merFISH(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)와 같은 멀티스케일 분석법은 다수의 서로 다른 mRNA31을 동시에 분석할 수 있습니다. 올리고뉴클레오티드 프로브와 오류 수정 코드를 결합한 이 방법은 단일 세포에서 수백 종의 RNA 종을 쉽게 검출할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
원고를 비판적으로 읽어준 알랭 뱅상(Alain Vincent)에게 감사한다. Zfh1 항체를 제공해주신 Ruth Lehmann에게 감사드립니다. Stephanie Dutertre와 Xavier Pinson이 MRic 이미징 플랫폼의 컨포칼 현미경 검사에 도움을 준 것에 감사드립니다. EL은 ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique의 박사 펠로우십의 지원을 받습니다. NA는 AFM-Telethon Ph.D. 펠로우십 23846의 지원을 받습니다. TP는 T.P.(2019-198009)에 대한 Chan Zuckerberg Initiative DAF 보조금으로 자금을 조달합니다. HB는 CNRS, Atip Avenir 프로그램 및 AFM-Telethon 트램펄린 보조금 23108의 지원을 받습니다.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |