Drosophila is een gerenommeerd model voor het bestuderen van sleutelmoleculen die myogenese reguleren. De huidige methoden zijn echter onvoldoende om de mRNA-transcriptiedynamiek en ruimtelijke verdeling binnen syncytie te bepalen. Om deze beperking aan te pakken, optimaliseerden we een RNA-fluorescentie in situ hybridisatiemethode die de detectie en kwantificering van mRNA’s op een schaal van één molecuul mogelijk maakt.
Skeletspieren zijn grote syncytieën die bestaan uit vele gebundelde myovezels die krachten produceren en lichaamsbeweging mogelijk maken. Drosophila is een klassiek model om spierbiologie te bestuderen. De combinatie van zowel Drosophila-genetica als geavanceerde omics-benaderingen leidde tot de identificatie van belangrijke geconserveerde moleculen die spiermorfogenese en regeneratie reguleren. De transcriptionele dynamiek van deze moleculen en de ruimtelijke verdeling van hun boodschapper-RNA binnen de syncytie kunnen echter niet worden beoordeeld met conventionele methoden. Hier optimaliseerden we een bestaande single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) methode om de detectie en kwantificering van individuele mRNA-moleculen in volwassen vliegspieren en hun spierstamcellen mogelijk te maken. Als proof of concept hebben we de mRNA-expressie en -verdeling van twee evolutionair geconserveerde transcriptiefactoren, Mef2 en Zfh1/Zeb, geanalyseerd. We laten zien dat deze methode enkele mRNA-moleculen efficiënt kan detecteren en kwantificeren voor zowel transcripten in de spiervoorlopercellen, volwassen spieren als spierstamcellen.
Volwassen skeletspieren zijn gemaakt van gedifferentieerde meerkernige myovezels waarvan de contractiele eigenschappen bewegingen genereren. Spiergroei, -onderhoud en -regeneratie zijn afhankelijk van spiervoorlopercellen en spierstamcellen (MuSC’s) die tijdens de embryonale ontwikkeling worden gespecificeerd1. Het myogene programma wordt nauwkeurig gecontroleerd door een reeks myogene transcriptiefactoren (TF’s) (bijv. Pax3/7, MYOD, Mef2 en ZEB)2,3,4. Het ontcijferen van de moleculaire mechanismen die de spierbiologie reguleren is belangrijk voor het ophelderen van fundamentele myologie-gerelateerde vragen en voor mogelijk therapeutisch gebruik bij de behandeling van spierdegeneratieve ziekten.
Drosophila heeft een lange geschiedenis als genetisch model om myogenese te bestuderen5. Het is onlangs naar voren gekomen als een nieuw model om spierregeneratiete onderzoeken 6,7,8. De spierstructuur en myogene kernprogramma’s zijn sterk geconserveerd tussen vliegen en zoogdieren. De TF’s Mef2 en Zfh1/ZEB hebben bijvoorbeeld een geconserveerde functie bij het reguleren van spierontwikkeling en -regeneratie 3,9,10,11. Volwassen Drosophila-spieren, zoals de Indirect Flight Muscles (IFM’s), worden gevormd uit een specifieke populatie van MuSC’s, bekend als Adult Muscle Progenitors (AMP’s)12. Deze AMP’s worden gespecificeerd tijdens de embryogenese en associëren zich met epitheelstructuren zoals vleugel- en beenschijven. Gedurende embryonale en larvale stadia blijven AMP’s ongedifferentieerd tot metamorfose wanneer ze zich bezighouden met differentiatie en fusie om de IFM’s te vormen13,14. De TF Spalt major (spalt, salm) komt tot expressie tijdens de ontwikkeling van de vliegspieren en is nodig om hun structurele identiteit te bepalen15. Mef2 is een andere belangrijke myogene TF die essentieel is voor de spiervorming bij volwassenen16,17. Het wordt uitgedrukt in de AMP’s en gehandhaafd in de IFM’svoor volwassenen 10,18. Terwijl de meerderheid van de AMP’s differentieert in functionele spieren, ontsnapt een subset aan differentiatie en vormt de volwassen MuSC’s11. Net als bij gewervelde dieren is de TF Zfh1/ZEB nodig om voortijdige differentiatie van de volwassen MuSC’s te voorkomen en hun stam te behouden 9,10.
Het is bewezen dat de dynamiek van genexpressie verschillende spierbiologische processen reguleert19,20. De komst van high-throughput single-cell en single-nuclei RNA-sequencingtechnieken heeft een uitgebreide verkenning van deze transcriptionele dynamiek mogelijk gemaakt21,22. Een opmerkelijke beperking van deze benaderingen is hun onvermogen om de ruimtelijke verdeling van mRNA-moleculen in de meerkernige spiervezels te bieden. Deze kenmerken kunnen worden onderzocht door middel van fluorescentie in situ hybridisatie met één molecuul (smFISH) die twee soorten mRNA-lichamen onthult: 1. Individuele mRNA-moleculen verspreid in het cytoplasma en vertegenwoordigen het volwassen RNA en 2. Maximaal twee heldere nucleaire brandpunten komen overeen met het ontluikende transcript en onthullen de transcriptioneel actieve allelen23. Daarom is smFISH een voorkeursmethode voor de kwantificering van individuele mRNA-moleculen, waarbij hun ruimtelijke verdeling wordt onderzocht en momentopnamen worden gemaakt van de gentranscriptiedynamiek.
De smFISH-methode is gebaseerd op een reeks korte fluorescerende oligonucleotidesondes die speciaal zijn ontworpen om complementair te zijn aan het doeltranscript. Bij het gloeien genereert het puntbronnen met hoge intensiteit die de detectie van mRNA op het niveau van één molecuul mogelijk maken met behulp van confocale microscopie24. Deze methode wordt in toenemende mate toegepast voor een breed scala aan celtypen, waaronder spierweefsel van zoogdieren19,20. In Drosophila, net als bij andere diermodellen, is de meeste kennis over genexpressie van volwassen spieren echter afgeleid van bulk moleculaire assays, die kwantitatieve informatie missen over de ruimtelijke locatie van mRNA-moleculen. Hier hebben we een methode geoptimaliseerd voor het uitvoeren van smFISH op spiervoorlopercellen en volwassen Drosophila-spieren 23,25. Dit protocol omvat een volledig geautomatiseerde analysepijplijn voor segmentatie van kernen en het tellen en lokaliseren van mRNA.
De toepassing van de smFISH-methode heeft de laatste tijd aan populariteit gewonnen, waarbij het gebruik ervan zich uitstrekt tot verschillende celtypen en modelorganismen. In het geval van Drosophila is de meeste kennis over genexpressie van volwassen spieren echter afgeleid van bulkmoleculaire assays, die geen kwantitatieve informatie opleveren over de precieze ruimtelijke locatie van mRNA-moleculen. Om deze kloof te dichten, hebben we een methode geoptimaliseerd voor het uitvoeren van smFISH op spiervoorlopercellen en volwassen Drosophila-spieren . Deze aanpak is aangepast van een eerder gepubliceerd protocol23 en geoptimaliseerd voor Drosophila-spierweefsels .
Het grootste obstakel bij het verkrijgen van smFISH-beelden van hoge kwaliteit is de dikte van volwassen spieren, wat de optimale penetratie van sondes belemmert. Daarom is het van cruciaal belang om de volwassen spieren te scheiden van de andere weefsels van het dier en het hybridisatieproces met milde agitatie uit te voeren. Deze specifieke stap zorgt voor een effectieve permeabilisatie van de weefsels.
Een ander cruciaal aspect is dat de signaal-ruisverhouding ervoor kan zorgen dat de computationele pijplijn faalt bij het detecteren van bepaalde mRNA-spots. We ontdekten dat het verhogen van de signaal-ruisverhouding kan worden bereikt door de optimale concentratie van sondes te vinden. De optimale verdunning kan verschillen afhankelijk van de samenstelling van elke sondeset, inclusief de samenstelling van de geconjugeerde kleurstof en oligonucleotide. We raden aan om verschillende verdunningen te proberen; een uiteindelijke verdunning van 200 nM leverde in deze experimenten de beste signaal-ruisverhouding op voor volwassen weefsels.
Met de smFISH-methode is het mogelijk om het aantal nieuw gesynthetiseerde RNA’s op de TS-foci te kwantificeren. Wanneer een gen actief wordt getranscribeerd, worden meerdere ontluikende RNA’s tegelijkertijd geproduceerd bij de TS. Als gevolg hiervan zal de intensiteit van de TS die van volwassen cytoplasmatisch RNA overtreffen, en deze eigenschap, gecombineerd met de nucleaire lokalisatie, kan de TS onderscheiden van individuele cytoplasmatische RNA’s. In de context van de spierbiologie zijn TS-detectie en -kwantificering bijzonder belangrijk voor het bepalen van de synchronisatie van transcriptie van een specifiek gen tussen spierkernen binnen hetzelfde syncytium. Deze computationele pijplijn is echter niet ontworpen om onderscheid te maken tussen cytoplasmatisch mRNA- en TS-signalen. Als alternatief raden we aan om deze smFISH-methode te combineren met andere beproefde smFISH-analysetools, zoals BayFISH of FISH-quant29,30. Het is bewezen dat deze tools geautomatiseerde segmentatie- en fluorescentie-intensiteitsberekeningen van RNA-aggregaten met opmerkelijke precisie mogelijk maken.
Ten slotte, hoewel smFISH mRNA-moleculen met een hoge ruimtelijke resolutie detecteert, is het beperkt tot het tegelijkertijd analyseren van een klein aantal mRNA. Multischaalmethoden zoals merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) maken de gelijktijdige analyse van een groot aantal verschillende mRNA’smogelijk 31. Door oligonucleotide-sondes en foutcorrigerende codes te combineren, vergemakkelijkt deze methode de detectie van honderden RNA-soorten in afzonderlijke cellen.
The authors have nothing to disclose.
We danken Alain Vincent voor zijn kritische lezing van het manuscript. We danken Ruth Lehmann voor het verstrekken van het Zfh1-antilichaam. We zijn dankbaar voor de hulp van Stephanie Dutertre en Xavier Pinson voor confocale microscopie op het MRic Imaging Platform. EL wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA wordt ondersteund door de AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP wordt gefinancierd door een Chan Zuckerberg Initiative DAF-subsidie aan TP (2019-198009). HB wordt ondersteund door CNRS, het Atip Avenir-programma en de AFM-Telethon trampoline subsidie 23108.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |