이 프로토콜은 마우스 모델에서 정확하고 재현 가능한 각막 및 윤부 알칼리 손상을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 고도로 구부러진 쥐의 각막과 변두리에 고르게 분포된 손상을 허용하기 때문에 유리합니다.
각막은 시력에 매우 중요하며, 외상 후 각막 치유는 각막의 투명성과 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 각막 손상 모델 연구를 통해 연구자들은 각막이 어떻게 치유되는지에 대한 이해를 높이고 각막 혼탁을 예방하고 관리하기 위한 전략을 개발하는 것을 목표로 합니다. 화학적 손상은 쥐를 대상으로 광범위하게 연구된 가장 인기 있는 부상 모델 중 하나입니다. 대부분의 이전 연구자들은 각막 손상을 유도하기 위해 수산화나트륨에 적신 납작한 종이를 사용했습니다. 그러나 납작한 여과지를 사용하여 각막 및 사지 손상을 유도하는 것은 쥐의 각막이 매우 구부러져 있기 때문에 신뢰할 수 없습니다. 여기에서 우리는 연구원들이 쥐 각막과 변두리에 잘 둘러싸여 있고 국소적이며 고르게 분포된 알칼리 손상을 만들 수 있도록 하는 새로운 도구인 수정된 생검 펀치를 제시합니다. 이 펀치-트레핀 방법을 통해 연구자들은 눈꺼풀과 같은 다른 구조는 화학 물질의 영향을 받지 않고 전체 쥐 각막과 변두리에 정확하고 재현 가능한 화학적 화상을 유도할 수 있습니다. 또한, 본 연구는 내측 척추를 지구의 비강 쪽을 식별하기 위한 랜드마크로 보존하는 적출 기술을 소개합니다. 구근과 구개 결막, 눈물샘도 이 기술을 사용하여 온전하게 유지됩니다. 안과 검사는 부상 후 0, 1, 2, 6, 8 및 14일에 세극등 생체현미경과 플루오레세인 염색을 통해 수행되었습니다. 임상적, 조직학적, 면역조직화학적 소견은 모든 실험 마우스에서 윤부 줄기세포 결핍과 안구 표면 재생 실패를 확인했습니다. 제시된 알칼리 각막 손상 모델은 변연 줄기 세포 결핍, 각막 염증 및 섬유증을 연구하는 데 이상적입니다. 이 방법은 쥐 각막 표면에 대한 국소 안과 약물의 전임상 및 임상 효능을 조사하는 데에도 적합합니다.
각막은 시력에 매우 중요하며 선명한 시력의 전제 조건인 투명도를 포함한 고유한 특성을 나타냅니다. 각막은 중요한 보호 역할을 할 뿐만 아니라 눈의 굴절력의 2/3를 차지합니다1. 각막 손상과 혼탁은 시력에 중요한 역할을 하기 때문에 시력을 크게 저하시키며 전 세계적으로 예방 가능한 실명의 두 번째로 높은 원인입니다 2,3. 심각한 윤부 기능 장애를 동반한 각막 손상에서는 변연의 장벽 기능이 감소하여 결막 세포가 각막 표면으로 이동하고 각막 결막형성 4,5로 시력이 급격히 저하됩니다. 따라서 각막 실명 및 관련 장애의 전 세계적인 부담을 해결하기 위해 효과적인 예방 및 치료 전략이 필요합니다.
인간의 각막 상처 치유 과정에 대한 현재의 이해는 다양한 부상에 대한 각막 반응을 조사한 이전 연구를 기반으로 합니다. 다양한 화학적 또는 기계적 각막 손상을 유도하고 각막 상처 치유 과정의 다양한 측면을 조사하기 위해 여러 기술과 동물 모델이 사용되었습니다 6,7,8,9.
알칼리 연소 모델은 수산화나트륨(NaOH)을 각막 표면에 직접 도포하거나 평평한 여과지(10)를 사용하여 수행되는 잘 정립된 손상 모델입니다. 알칼리 손상은 전염증성 매개체의 방출과 눈의 각막과 전방뿐만 아니라 망막에도 다형성 핵 세포의 침윤을 초래합니다. 이는 의도하지 않은 망막 신경절 세포 사멸(retinal ganglion cell apoptosis)과 CD45+ 세포 활성화를 유도한다11. 따라서 알칼리 손상 모델을 사용하여 의도하지 않은 과도한 부상을 방지하기 위해 부상 부위의 위치를 정확하게 파악하는 것이 중요합니다.
쥐 안구의 축 길이는 약3mm12이다. 각막과 망막 사이의 거리가 짧기 때문에 가파른 각막 곡률은 망막에 빛을 집중시키는 높은 굴절력을 제공합니다(그림 1A). 앞서13에서 보고한 바와 같이, 평평한 여과지를 사용하여 이 고도로 구부러진 표면에 화학적 손상을 입히는 것은 특히 림버스에서 어렵습니다(그림 1B). 변막에 손상을 입히기 위해서는 여과지를 기울여야 하는데, 이는 결막과 인접한 결막에 의도하지 않은 부상을 입힐 가능성이 있다14. 또 다른 방법은 화학 약품을 각막 표면에 방울로 직접 바르는 것입니다. 그러나 이 방법은 노출 시간에 대한 제어가 부족하고 액체가 이러한 영역으로 확산되어 결막, 위협 및 눈꺼풀에 부상을 유발할 수 있는 잠재적인 위험이 있습니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구는 부상을 유발하는 새로운 펀치-트레핀 방법을 제시합니다. 이 기술은 (i) 마우스 모델에서 전체 각막 표면 및 변연에 효과적인 화학적 손상을 유도하고, (ii) 각막에 국소적이고 잘 둘러싸인 손상을 유도하고, (iii) 미리 결정된 기간 동안 관심있는 액체를 적용할 수 있는 능력, (iv) 적절한 생검 펀치를 선택하여 다양한 크기의 각막 손상을 유도하는 능력을 포함한 몇 가지 이점을 가지고 있습니다. 이 방법은 각막 표면이 구부러져 있고 안구 표면 상처 치유를 연구하는 데 사용되는 일반적인 동물 모델인 쥐 및 토끼 부상 모델에도 가능합니다.
이 연구는 마우스 모델에서 효과적이고 재현 가능한 각막 및 연부 손상을 성공적으로 유도하는 데 사용할 수 있는 혁신적인 장치인 펀치-트레핀을 제안합니다. 이 윤부 줄기 세포 결핍 모델은 각막 상처 치유 및 손상 후 결막화의 역학을 조사하는 데 이상적입니다.
증거는 쥐 각막의 가장자리 틈새와 중앙 부분 모두 줄기 세포(30)를 포함하고 있음을 시사한다. 따라서, 줄기세포 결핍 모델을 생성하기 위해서는 효율적인 각막 및 변측 손상이 필요하며, 여기에 제시된 손상 모델은 특정 기간 동안 구부러진 각막 림버스를 화학 약품에 노출시킬 수 있습니다. NaOH 손상의 최상의 농도와 지속 시간을 결정하기 위해 다양한 NaOH 농도 및 지속 시간으로 부상을 입혔습니다. NaOH 농도가 높거나 노출 시간이 길면 조직 손상과 섬유화가 증가했습니다. 따라서 연구자들은 연구의 특정 목표와 원하는 부상 정도에 따라 이러한 매개변수를 조정할 수 있습니다.
이 각막 및 변부 손상 모델을 성공적으로 재현하려면 몇 가지 주요 고려 사항을 고려해야 합니다. 먼저, 펀치의 적절한 크기를 결정하기 위해 표적 눈의 limbal-limbal 직경을 측정하는 것이 필수적입니다. 이 직경보다 0.5 – 1 mm 더 큰 외경을 가진 생검 펀치를 선택하는 것이 좋습니다.
사용된 액체의 표면 장력은 그림 1G와 같이 안구 표면과 펀치 트레핀 가장자리 사이의 계면에서 누출을 방지하는 데 중요한 요소입니다. 따라서 펀치 생검의 끝부분에 압력을 가할 필요가 없습니다.
조직에 기계적 손상을 입히지 않으려면 펀치 트레핀을 눈과 평행한 축으로 잡고 림버스에 압력을 가하지 않는 것이 중요합니다. 펀치 트레핀 축을 부적절하게 조정하면 누출 위험이 증가하고 부상 부위가 손상되고 부정확한 결과가 발생할 수 있습니다.
이 기술의 몇 가지 잠재적인 한계에는 적절한 펀치 크기를 선택해야 하는 필요성, 펀치 트레핀을 잡는 숙련도 및 기계적 부상을 유발할 수 있는 잠재적 위험이 포함됩니다. 그러나 이러한 한계는 연습을 통해 그리고 이 프로토콜에 설명된 지침을 따라 극복할 수 있습니다. 마우스의 균주와 연령 범위는 재상피화 과정에 영향을 미치는 다른 요인이며 연구에서 고려해야 합니다.
더욱이, 제안된 프로토콜은 구근 및 구개뇌 결막을 보존하고 외과적 봉합사를 마커로 적용하지 않고도 구체의 코 부분을 결정할 수 있는 적출 방법을 자세히 설명하기 때문에 유리합니다. 이전 연구에 따르면 눈의 코 영역은 각막의 다른 영역에 비해 신경 신경 분포가 가장 낮기 때문에 신생혈관 형성에 더 취약하고 재생 효능이 감소합니다31,32.
요약하면, 각막 혼탁(CO), 지속적인 상피 결손 및 각막 신생혈관화(NV)와 같은 LSCD의 임상 징후와 함께 잔 세포 화생, 각막 표면의 K13 발현, 각막 표면의 K12 부재를 포함한 관찰된 조직학적 변화는 이 모델에서 LSCD의 존재를 확인합니다. 이러한 발견은 이 새로운 기술이 LSCD를 유도하는 데 효과적이라는 증거를 제공합니다. 이 화학적 손상 모델은 각막 손상 및 재생 분야에서 새로운 약물 및 약물 치료를 조사하기 위한 전임상 연구에 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 NEI P30-EY026877가 이 연구를 지원한다는 것을 인정합니다. 우리는 실험 동물을 제공하는 데 도움을 준 스탠포드 대학의 줄기 세포 생물학 및 재생 의학 연구소의 Charlene Wang과 Irv Weissman Lab 박사에게 깊은 감사를 드립니다. 이미지 준비 및 편집에 도움을 주신 Hirad Rezaeipoor의 도움에 감사드립니다.
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |