这里介绍的是一种可重复、经济实惠且稳健的方法,用于分离和扩增原代支气管上皮细胞以进行长期生物样本库,并通过在气液界面培养产生分化的上皮细胞。
气道上皮细胞层形成肺组织和外部环境之间的第一道屏障,因此不断暴露于吸入物质,包括传染因子和空气污染物。气道上皮层在多种急性和慢性肺部疾病中起核心作用,并且通过吸入进行针对该上皮的各种治疗。了解上皮在发病机制中的作用以及如何将其靶向用于治疗需要可靠且具有代表性的模型。 体外 上皮培养模型越来越多地被使用,并提供了在受控环境中进行实验的优势,使细胞暴露于不同种类的刺激、毒物或感染因子。使用原代细胞代替永生化或肿瘤细胞系的优点是,与细胞系相比,这些细胞在培养中分化为假分层极化上皮细胞层,上皮的代表性更好。
这里介绍的是一个强大的方案,在过去几十年中进行了优化,用于从肺组织中分离和培养气道上皮细胞。该程序允许通过在气液界面 (ALI) 上培养来成功分离、扩增、培养和粘液纤毛分化原发性支气管上皮细胞 (PBEC),并包括生物样本库方案。此外,还描述了使用细胞特异性标记基因表征这些培养物。这些 ALI-PBEC 培养物可用于一系列应用,包括暴露于全香烟烟雾或炎症介质,以及与病毒或细菌共培养/感染。
本手稿中提供的协议以逐步的方式说明了该程序,预计将为那些有兴趣在其实验室中实施或调整此类培养系统的人提供基础和/或参考。
气道上皮在各种急性和慢性肺部疾病中的作用已在各种综述中描述1,2,3,4,5,6,7。气道上皮细胞的良好分化培养是揭示气道上皮作用的重要工具。气液界面(ALI)气道上皮细胞培养广泛用于促进气道基底上皮细胞的分化,从而在体外可靠地研究气道上皮8,9。在过去的几年中,由于与 COVID-19 大流行相关的新研究计划以及全球向无动物研究的过渡,此类模型的使用进一步增加。因此,该模型细胞系的使用增加强调了共享程序和经验以获得稳健结果的必要性。这也将允许比较研究小组之间的结果。程序的稳健性是关键特征,因此需要进行质量控制。一些实验室已经投资开发在ALI培养原代气道上皮细胞的方案。详细共享这些程序时,可以减少时间、精力和所需的预算。这些细节包括,例如,由各种制造商提供的细胞培养塑料和培养基的选择,因为发现这会影响所获得的培养物的特性10,11,12。这强调了分享培养程序的经验和细节的重要性,因为如果没有这样的见解,结果可能会受到影响和/或各个实验室的验证工作可能会受到阻碍。
人肺上皮包括多种细胞类型,包括基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和俱乐部细胞等主要类型。为了在体外可靠地模拟气道中的上皮细胞层,需要在培养模型中表示这些细胞类型,并且它们的极化和功能保持13,14,15,16。认识到供体特征(包括疾病状态)和细胞的解剖起源(即鼻腔、气管、大气道和小气道)可能影响细胞培养物的细胞组成和功能反应同样重要。相关专业知识和实践是成功培养原代气道上皮细胞和直观(通过培养过程中的目视检查)和定量评估培养质量的先决条件。该贡献的目的是为原代人支气管上皮细胞(PBEC)的分离和培养提供一种经济和时间有效的方法,该方法也可以应用于气管和小气道上皮细胞的培养。除了描述从切除的肺组织中分离这些细胞的方法外,还介绍和讨论了一种扩增和生物库的方法,以及最终在合理的成本和时间段内建立和表征分化的ALI培养物的方法。
这里介绍的方案描述了从切除的肺组织中分离人支气管上皮细胞,一种在不损失分化潜力的情况下优化细胞扩增的方法,冷冻保存程序以及产生分化良好的ALI-PBEC培养物的程序。此外,还提供了质量控制的说明,以及监测和评估差异化的ALI-PBEC的说明。
所描述的方案从肉眼下正常的无肿瘤支气管环开始,该支气管环从接受与肺癌诊断相关的手术的患者的肺叶中切除。因此需要注意的是,这些环严格不能被视为健康组织,因此可能会影响细胞培养特性。获得支气管上皮细胞的替代来源包括使用支气管活检、支气管刷或来自移植供体或受体肺的组织。无论来源如何,在使用肺组织时,应考虑微生物污染的风险,因此在不同的培养基中使用抗生素以降低细胞培养物微生物污染的风险。特别是,支原体在细胞培养中是一种高且常见的风险,因为它对细胞培养的影响多种多样,对细胞培养中常用的抗生素具有耐药性,并且支原体污染只能通过支原体检测测定来确认。因此,在从肺组织中分离细胞后的细胞培养初始阶段,使用广谱抗菌制剂Primocin,并且在培养过程中,随机选择的样品测试支原体的存在。
从支气管环开始的分离程序提供了足够的起始材料,允许这些原代细胞在ALI开始培养所需的扩增程度,而不会影响分化能力。然而,用有限数量的细胞开始扩增分离的上皮细胞可能会带来问题,即获得足够数量的插入片段和足够的细胞,可以接种用于ALI培养。原代细胞的扩展培养和重复传代可能导致复制性衰老。已经提出了各种解决方案来克服这一限制。Horani等人表明,Rho激酶抑制剂(ROCK)Y-27632增加了基底细胞的增殖30,Mou等人利用双重Smad抑制在保持分化上皮细胞层特性的同时扩增基底干细胞31,Sachs等人开发了一种气道类器官系统,可用于扩增气道上皮细胞并在多次传代过程中保持其分化潜力32.后一种方法还用于从细胞数量非常低的来源扩增细胞,例如早产儿(<28 周胎龄)的气管抽吸物 (TA) 和支气管肺泡灌洗液 (BAL),然后转移到 ALI 培养物中,如此处所述33。结果发现,从BAL和TAs分离的细胞显示出与支气管组织产生的细胞相似的分化能力,尽管当分化偏向使用Notch信号抑制或Th2细胞因子IL-1333的更纤毛或含有杯状细胞的培养物时观察到差异。因此,建议如果使用类似方法从具有低上皮细胞数的起始材料培养ALI-PBEC,请始终检查培养物的基本质量标准,如协议第6节所述。重要的是,使用饲养层细胞也可能有助于获得更大的细胞数量,这在时间和细胞数量至关重要的可移植支架工程环境中至关重要。一项研究说明了这一点,其中自体上皮细胞从来自气管疾病患者的活检中培养,并且在鼠胚胎饲养层(有丝分裂灭活的 3T3-J2 成纤维细胞)和上述 Rho/ROCK 途径抑制剂 (Y-27632)的存在下细胞迅速扩增34。发现所得细胞培养物可用于气管支架的再增殖,因此这可以被视为移植模型的合适方案。
当使用本贡献中描述的方案时,以及使用其他培养方案时,不可避免地会引入选择偏差。重要的是要认识到,方案细节的差异,例如用于启动培养物的细胞来源、培养基组成和其他方案细节,可能导致培养物的细胞组成发生变化,从而改变ALI培养物的反应33,35。此外,在比较用于分化气道细胞的不同培养基时,也观察到细胞特性的差异10,11。在比较PneumaCult和cBD培养基时,观察到杯状细胞和俱乐部细胞mRNA标记物,TEER值和细胞层厚度的差异。基于这些观察结果,尽管缺乏统计基础,但由于使用的供体数量少,客户不知道培养基成分,以及PneumaCult培养基的成本较高,我们的实验室决定使用cBD培养基。
如前所述,细胞最初可以使用类器官培养物扩增,随后转移到2D ALI插入系统。这一点很重要,因为气道上皮类器官不适合暴露于空气中的物质,而使用ALI 2D系统可以评估空气中物质(如香烟烟雾23,36)对培养的气道上皮细胞的影响。建立ALI气道上皮细胞培养物的另一种方法是通过人多能干细胞(hiPSC)的分化产生气道上皮细胞37。在此类方案中,在分化为近端气道祖细胞后的分化方案的最后阶段,可以使用类似于此处描述的程序通过培养到ALI来分化细胞。
在当前的协议中,cBD培养基用于ALI的培养。cBD培养基是一种无血清培养基,通过添加不同补充剂的混合物而制备,灵感来自Fulcher等人38 以及其他研究。补充溶液含有 52 μg/mL 牛垂体提取物 (BPE)、0.5 μg/mL 氢化可的松、0.5 ng/mL 人 EGF、0.5 μg/mL 肾上腺素、10 μg/mL 转铁蛋白、5 μg/mL 胰岛素、6.5 ng/mL 三碘甲状腺原氨酸和 0.1 ng/mL RA39。由于BPE是一种组织提取物,并且会受到批次变化的影响,因此该培养基不能被视为完全定义的培养基,也不是无动物的。最好使用完全定义的细胞培养基,以最大程度地减少批次间的差异。鉴于向无动物研究的过渡,重要的是要努力生产不含动物产品且科学界负担得起的特定培养基。
根据研究问题,可以使用基于ALI模型的各种实验设置。例如,为了研究可能影响分化过程的化合物的影响,可以通过在浸没培养的不同阶段、分化期间或分化良好阶段将化合物添加到培养物中来解决。ALI-PBEC培养物的细胞组成可以通过添加特定化合物来影响;例如,在IL-13存在下分化ALI-PBEC会产生具有更多杯状细胞和更少纤毛细胞的培养物,而在分化过程中使用γ分泌酶抑制剂DAPT(用于阻断Notch信号传导)处理导致具有更多纤毛细胞的培养物,而牺牲杯状细胞23,40,41,42。
此外,刺激细胞或阻断某些过程的试剂可以应用于基底隔室或(体积非常小)培养物的顶端隔室。细胞也可以从顶端暴露于空气中的物质。这种暴露设计已被用于研究柴油机尾气或整个香烟烟雾对PBEC的影响23,43,44。每次更换培养基时都可以收获培养基以监测基底侧分泌的蛋白质;这同样适用于用PBS洗涤的细胞顶端,同时刷新基础培养基。收获所谓的顶端洗涤液,并添加可选的二硫代赤藓糖醇(DTE)以更有效地解离由杯状细胞产生的粘液。可以获得细胞裂解物以分离总蛋白、RNA 以及染色体和线粒体 DNA。可以使用特异性标记物的抗体进一步研究细胞,方法是从塑料插入物上切割聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜,并将该膜进一步切割成更小的碎片以进行多次免疫荧光染色45。此外,流式细胞术或FACS也可以在插入片段中的细胞胰蛋白酶消化后使用。在ALI阶段,可以通过测量电阻并随后计算TEER来监测细胞屏障的发展,其中电阻与膜插入物的表面积成反比。计算基于欧姆定律,使用以下公式:,其中Rm是测量的电阻,Rb是没有涂层和电池的插入物的基线电阻,SA是插入物膜的表面积。使用EVOM2和STX/筷子电极测量电阻很简单,但在将其引入孔中时,高度依赖于处理程序。同样,电极的形状已被提出影响测量相对较大的表面积17的阻挡函数。
ALI细胞培养系统的进一步改进,旨在提高准确的组织表征,包括其他细胞类型的共培养,例如白细胞,成纤维细胞或内皮细胞46,47,48。已经观察到,ALI-PBEC与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或M-CSF分化的巨噬细胞共培养显着影响先天上皮反应和修复48。需要注意的是,在这种共培养模型中,介质兼容性可能是一个问题。由于用于气道上皮细胞培养的培养基是专门为PBEC开发的,可能不适合其他细胞类型,因此需要进行优化。在气道生物学领域可以看到的另一种可以使用隔离PBEC的进步是使用器官芯片(OoC)技术49,50。使用这项技术,可以研究呼吸和血液流动的机械力的影响,例如拉伸、空气和介质流动 29.
当使用来自不同供体的PBEC时,供体间变异性可能很大,因此在上皮细胞培养研究中考虑使用来自多个供体的细胞来解释这种变异性非常重要。由于ALI-PBEC的培养非常耗时且成本高昂,因此研究了通过将来自不同供体的细胞混合在一个细胞培养插入物中来建立ALI-PBEC培养物的选择。这样,在分析来自各种个体供体的培养物的反应之前,可以使用原代细胞轻松进行试点实验。此外,可以将具有不同特征(例如,不同年龄类别或性别)的捐赠者分组进行探索性研究。当使用供体混合物时,重要的是要确保存在相同数量的不同供体的细胞,以防止由于较高的增殖率而导致一个供体主导结果的可能性。因此,与来自单个供体的接种细胞相比,来自单个供体的细胞被单独扩增并以更高的密度接种在插入物中,以在过渡到ALI之前最大限度地减少插入物中的增殖。通过研究SARS-CoV-2的感染动力学,比较了供体混合物和相应个体供体的反应。使用RT-qPCR和免疫荧光染色,观察到供体混合物通过显示相似数量的病毒颗粒和相似数量的感染细胞28,提供了各种个体供体的良好代表性。
为了成为动物模型可接受的替代方案,培养的支气管上皮细胞的基因编辑应该是可行的51。研究了在ALI-PBEC中使用小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰技术,但是由于细胞需要在培养的浸没期用siRNA转染,因此在ALI培养过程中由于培养持续时间长而无法充分维持敲低,除非在培养过程中经常重复siRNA转染52.然而,siRNA可以成功地用于修饰浸没基底细胞中的基因表达。其他人已经成功地使用CRISPR / Cas9技术在原代ALI气道上皮细胞培养物中实现了核糖核蛋白(RNP)递送的基因编辑 53。当使用这种技术时,细胞必须保持其完全的分化能力。由于原代气道细胞培养物不能无限期传代,基因编辑细胞的克隆扩增并不容易,并且添加培养基以选择转染细胞很麻烦。因此,很难在所有培养的细胞中实现所需的敲低。产生敲除克隆的另一种方法是在hiPSC54 中使用敲除策略并使用这些细胞产生气道上皮细胞。另一种尽管不是最佳的替代方案是建立永生化的PBEC系,以便克隆扩增基因编辑的细胞55。
这里提出的协议是生成分化良好的伪分层ALI-PBEC的一种方法,但也发现其他协议可以建立这种培养物,与所提出的协议相比,差异越来越小。我们认为,培养方法的实验室验证和严格的质量控制对于ALI-PBEC系统和气道上皮细胞的类似培养系统至关重要,成为动物实验的有效替代方案。
The authors have nothing to disclose.
使用本贡献中描述的模型的研究得到了各种资助组织的支持,包括荷兰肺脏基金会、荷兰卫生研究与发展组织(ZonMw,COVID-19 MKMD 赠款)、荷兰动物试验替代协会(Stichting Proefdiervrij,赠款 #114025007),以及勃林格殷格翰和加拉帕戈斯等公司的研究资助。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |