Summary

تحريض التهاب دواعم السن عن طريق مزيج من حقن الرباط وعديد السكاريد الشحمي في نموذج الفئران

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

في هذه الدراسة ، تم تقديم نموذج الفئران لتحريض التهاب اللثة عن طريق مزيج من الرباط المحتجز والحقن المتكرر من عديد السكاريد الدهني المشتق من Porphyromonas gingivalis ، على مدار 14 يوما حول الأضراس الفكية الأولى. كانت تقنيات الربط وحقن LPS فعالة في إحداث التهاب القلفة ، مما أدى إلى فقدان العظم السنخي والالتهاب.

Abstract

التهاب دواعم السن (PD) هو مرض التهابي مناعي مزمن منتشر للغاية يصيب اللثة ، مما يؤدي إلى فقدان الأنسجة الرخوة اللثوية والأربطة اللثوية والملاط والعظام السنخية. في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة بسيطة لتحريض PD في الفئران. نحن نقدم تعليمات مفصلة لوضع نموذج الرباط حول الأضراس الفكية الأولى (M1) ومجموعة من حقن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، المشتقة من Porphyromonas gingivalis في الجانب المتوسط الحنكي من M1. تم الحفاظ على تحريض التهاب اللثة لمدة 14 يوما ، مما يعزز تراكم البكتيريا الحيوية والالتهابات. للتحقق من صحة النموذج الحيواني ، تم تحديد IL-1β ، وهو وسيط التهابي رئيسي ، بواسطة مقايسة مناعية في السائل اللثوي (GCF) ، وتم حساب فقدان العظام السنخية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالشعاع المخروطي (CBCT). كانت هذه التقنية فعالة في تعزيز تراجع اللثة ، وفقدان العظام السنخية ، وزيادة مستويات IL-1β في الصندوق الأخضر للمناخ في نهاية الإجراء التجريبي بعد 14 يوما. كانت هذه الطريقة فعالة في تحفيز مرض باركنسون ، وبالتالي يمكن استخدامها في الدراسات حول آليات تطور المرض والعلاجات المستقبلية الممكنة.

Introduction

التهاب دواعم السن (PD) هو سادس أكثر حالات الصحة العامة انتشارا في جميع أنحاء العالم ، حيث يؤثر على حوالي 11٪ من إجمالي السكان ، كونه شكلا متقدما لا رجعة فيه ومدمرا لأمراض اللثة 1,2. PD هي عملية التهابية تؤثر على أنسجة اللثة واللثة ، مما يؤدي إلى تراجع اللثة ، والهجرة القمية للظهارة الموصلية مع نمو الجيب ، وفقدان العظم السنخي3. علاوة على ذلك ، يرتبط مرض باركنسون بالعديد من الأمراض الجهازية ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والسمنة والسكري والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والتي تلعب العوامل البيئية والعوامل الخاصة بالمضيف دورا مهمافي 4,5.

ومن ثم ، فإن مرض باركنسون هو مرض متعدد العوامل يبدأ في المقام الأول من خلال تراكم البلاك الميكروبي – الناتج عن dysbiosis للمجتمعات الميكروبية – والاستجابة المناعية للمضيف المبالغ فيها لمسببات الأمراض اللثوية ، مما يؤدي إلى انهيار أنسجة اللثة 4,6. من بين العديد من بكتيريا اللثة ، تعد البكتيريا اللاهوائية سالبة الجرام Porphyromonas gingivalis واحدة من مسببات الأمراض الرئيسية في PD4. يحتوي P. gingivalis على عديد السكاريد الدهني المعقد (LPS) في جدرانه ، وهو جزيء معروف بتحفيز تسلل كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال النووية وتوسع الأوعية الدموية في أنسجة اللثة الملتهبة7. ينتج عن هذا إنتاج وسطاء التهابيين ، مثل إنترلوكين 1 (IL-1) و IL-6 و IL-8 ، عامل نخر الورم (TNF) ، أو البروستاجلاندين ، مع تنشيط ناقضة العظم اللاحقة وارتشاف العظام ، مما يؤدي إلى تدمير الأنسجة وفقدان الأسنان في نهاية المطاف3.

من بين المزايا المختلفة للنماذج الحيوانية القدرة على تقليد التعقيدات الخلوية كما هو الحال في البشر ، أو أن تكون أكثر دقة من الدراسات المختبرية ، والتي تتم على الأسطح البلاستيكية ذات أنواع الخلايا المحدودة8. لنمذجة PD تجريبيا في الجسم الحي ، تم استخدام أنواع حيوانية مختلفة ، مثل الرئيسيات غير البشرية والكلاب والخنازير والقوارض والأرانب والفئران والجرذان9. ومع ذلك ، فإن الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر دراسة على نطاق واسع للتسبب في مرض باركنسون لأنها غير مكلفة ويسهل التعامل معها10. تتميز أنسجة اللثة السنية بسمات هيكلية مماثلة لأنسجة اللثة البشرية ، مع تلم اللثة الضحل وظهارة الموصل متصلة بسطح السن. علاوة على ذلك ، كما هو الحال في البشر ، تسهل الظهارة الموصلية مرور المواد البكتيرية والغريبة والإفرازات من الخلايا الالتهابية 9.

أحد أكثر النماذج التجريبية التي تم الإبلاغ عنها لتحريض PD في الفئران هو وضع الأربطة حول الأسنان ، وهو أمر صعب تقنيا ولكنه موثوقبه 10. يسهل وضع الرباط لوحة الأسنان وتراكم البكتيريا ، مما يؤدي إلى حدوث dysbiosis في التلم اللثوي ، والذي يسبب التهاب أنسجة اللثة وتدميرها11. يمكن أن يحدث فقدان ارتباط اللثة وارتشاف العظم السنخي في 7 أيام في نموذج الفئران8.

نموذج حيواني آخر لمرض باركنسون يتكون من حقن LPS في أنسجة اللثة. نتيجة لذلك ، يتم تحفيز تكوين العظم وفقدان العظام. تتشابه السمات النسيجية المرضية لهذا النموذج مع مرض باركنسون الذي أنشأه الإنسان ، والذي يتميز بمستويات أعلى من السيتوكينات المسببة للالتهابات ، وتدهور الكولاجين ، وارتشاف العظام السنخية 6,8.

وبالتالي ، كان الهدف من هذه الدراسة هو وصف نموذج فئران بسيط لمرض باركنسون التجريبي بناء على تقنيات حقن P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) ، جنبا إلى جنب مع وضع الرباط حول أضراس الفك العلوي الأولى (M1). هذا نموذج له خصائص مماثلة لتلك التي لوحظت في مرض باركنسون البشري ، والذي يمكن استخدامه في دراسة آليات تطور المرض والعلاجات المستقبلية الممكنة.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي للدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات التابعة لمعهد البحوث الصحية لجزر البليار (CEEA-UIB ؛ الرقم المرجعي 163/03/21). 1. تخدير الحيوان وإعداد الإجراءات تعقيم جميع الأدوات الجراحية (كمامات الفم المصنوعة من ا?…

Representative Results

يتم عرض جدول زمني للخطوات التجريبية في الشكل 1. يوضح الشكل 2 أ صورة للفك السفلي بعد التدخل الجراحي ، مع وضع الرباط حول تلم M1 في الوقت 0 من التجربة. يوضح الشكل 2B كيف ، بعد 14 يوما من الإجراء ، يدخل الرباط حول M1 إلى التلم اللثوي ، مما يسبب التهاب الل…

Discussion

تصف هذه الطريقة تحريض PD في الفئران بعد تقنية مشتركة لحقن Pg-LPS ووضع الرباط حول M1 ، مما يكشف أنه يمكن إحداث تغييرات كبيرة في أنسجة اللثة والعظام السنخية في غضون 14 يوما بعد هذه الطريقة.

خلال هذا الإجراء ، يجب توفير الاهتمام بالخطوات الحاسمة المختلفة. أثناء تخدير الحيوانات و…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (دعوة إثبات المفهوم 2020) ، من قبل معهد الصحة كارلوس الثالث ، وزارة الاقتصاد والمنافسة ، بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي ESF وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي ERDF (عقد مع M.M.B; FI18/00104) ومن قبل المديرية العامة للتحقيقات، وكونسيلريا دي للتحقيقات، وحاكم باليار (عقد مع M.M.F.C; FPI/040/2020). يشكر المؤلفون الدكتورة آنا توماس وماريا تورتوسا على مساعدتهما في الجراحة التجريبية ومنصة IdISBa. أخيرا ، شكرا لكلية طب الأسنان ADEMA للوصول إلى الماسح الضوئي CBCT.

Materials

Adsorbent paper point nº30  Proclinc 8187
Aprotinin Sigma-Aldrich A1153
Atipamezole Dechra 573751.5 Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)  Laboratorio Arago Sl 613112
Buprenorphine  Richter pharma 578816.6 Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner  MyRay hyperion X9 Model Hyperion X9
CTAn software SkyScan Version 1.13.4.0
Dental explorer  Proclinc 99743
Diamond lance-shaped bur  Dentaltix IT21517
Food maintenance diet Sodispain research ROD14 
Heated surgical platform PetSavers
Hollenback carver Hu-FRIEDY  HF45234
Hypodermic needle   BD  300600 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM
Isoflurane  Karizoo Isoflutek 1000mg/g
Ketamine   Dechra 581140.6 Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis  InvivoGen TLRL-PGLPS
Methanol Fisher Scientific M/4000/PB08
Micro needle holter Fehling Surgical Instruments KOT-6
Microsurgical pliers KLS Martin 12-384-06-07
microsurgical scissors  S&T microsurgical instruments SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet Mindray 
Multiplex bead immunoassay Procartaplex, Thermo fisher Scientific PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich 8187151000
Periosteal microsurgical elevator  Dentaltix CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)  Roche 10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS) Capricorn Scientific PBS-1A
PhosSTOP  Roche 4906845001 Commercial phosphatase inhibitor tablet 
Plastic vial SPL Lifesciencies 60015 1.5mL
Saline Cinfa 204024.3
Stereo Microscope  Zeiss Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light Zeiss
Surgical scissors  Zepf Surgical 08-1701-17
Syringe  BD plastipak 303172 1mL
Veterinary dental micromotor Eickemeyer 174028
Xylazine Calier 20102-003 Xilagesic 20 mg/mL

References

  1. Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
  2. Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
  3. Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
  4. Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
  5. Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
  6. Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
  7. Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
  8. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
  9. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  10. Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
  11. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
  12. Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
  13. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  14. Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
  15. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  16. Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
  17. Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
  18. Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
  19. Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
  20. Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).

Play Video

Citer Cet Article
Munar-Bestard, M., Villa, O., Ferrà-Cañellas, M. d. M., Ramis, J. M., Monjo, M. Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model. J. Vis. Exp. (192), e64842, doi:10.3791/64842 (2023).

View Video