Summary

쥐 모델에서 합자와 지질다당류 주입의 조합을 통한 치주염 유도

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

이 연구에서는 첫 번째 상악 어금니 주위에서 14일 동안 Porphyromonas gingivalis에서 추출한 지질다당류의 유지 합자와 반복 주사의 조합을 통해 치주염 유도의 쥐 모델을 제시합니다. 결찰 및 LPS 주사 기술은 치조골 손실과 염증을 유발하는 근막염 유도에 효과적이었습니다.

Abstract

치주염(PD)은 치주 연조직, 치주 인대, 시멘트질 및 치조골의 손실을 초래하는 매우 만연한 만성 면역 염증성 질환입니다. 본 연구에서는 랫트에서 PD를 유도하는 간단한 방법을 설명한다. 우리는 첫 번째 상악 어금니(M1) 주위에 합자 모델을 배치하고 M1의 근심-구개 쪽에 있는 Porphyromonas gingivalis 에서 파생된 지질다당류(LPS) 주사의 조합에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 치주염의 유도는 14일 동안 유지되어 박테리아 생물막의 축적과 염증을 촉진하였다. 동물 모델을 검증하기 위해 주요 염증 매개체인 IL-1β를 치은 틈새액(GCF)에서 면역분석법으로 측정하고 원뿔형 컴퓨터 단층촬영(CBCT)을 사용하여 치조골 손실을 계산했습니다. 이 기술은 14일 후 실험 절차 종료 시 치은 후퇴, 치조골 손실 및 GCF의 IL-1β 수준 증가를 촉진하는 데 효과적이었습니다. 이 방법은 파킨슨병 유도에 효과적이어서 질병 진행 기전 및 향후 가능한 치료법에 대한 연구에 사용할 수 있습니다.

Introduction

치주염(PD)은 전 세계적으로 6번째로 널리 퍼진 공중 보건 질환으로, 전체 인구의 약 11%에 영향을 미치며, 진행성, 비가역적, 파괴적 형태의 치주 질환이다 1,2. PD는 치은 및 치주 조직에 영향을 미치는 염증 과정으로, 치은 후퇴, 포켓 발달을 동반한 접합 상피의 정점 이동, 치조골 손실을 초래합니다3. 또한, 파킨슨병은 심혈관 질환, 비만, 당뇨병 및 류마티스 관절염을 포함한 여러 전신 질환과 관련이 있으며, 환경 및 숙주 특이적 요인이 중요한 역할을 한다 4,5.

따라서, PD는 주로 미생물 군집의 dysbiosis로 인한 미생물 플라크의 축적과 치주 병원체에 대한 과장된 숙주 면역 반응에 의해 시작되어 치주 조직의 파괴를 초래하는 다인성 질환입니다 4,6. 여러 치주 박테리아 중에서 그람 음성 혐기성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis는 PD4의 주요 병원체 중 하나입니다. P. gingivalis는 염증이 있는 치주 조직에서 다형핵 백혈구 침윤 및 혈관 확장을 유도하는 것으로 알려진 분자인 복합 지질다당류(LPS)를 벽에 함유하고 있다7. 그 결과 인터루킨 1(IL-1), IL-6, IL-8과 같은 염증 매개체, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 프로스타글란딘이 생성되어 파골세포가 활성화되고 뼈 흡수가 일어나 조직 파괴와 궁극적인 치아 손실이 발생합니다3.

동물 모델의 다양한 장점 중에는 인간에서와 같이 세포 복잡성을 모방할 수 있는 능력, 또는 제한된 세포 유형의 플라스틱 표면에서 수행되는 시험관 내 연구보다 더 정확하다는 점이 있다8. 생체 내에서 PD를 실험적으로 모델링하기 위해 인간이 아닌 영장류, 개, 돼지, 흰 족제비, 토끼, 생쥐 및 쥐와 같은 다양한 동물 종이 사용되었습니다9. 그러나, 래트는 파킨슨병의 발병기전에 대해 가장 광범위하게 연구된 동물 모델인데, 그 이유는 이들이 저렴하고 다루기 쉽기 때문이다10. 그들의 치은 조직은 인간의 치은 조직과 유사한 구조적 특징을 가지고 있으며, 얕은 치은 고랑과 접합 상피가 치아 표면에 부착되어 있습니다. 또한, 인간과 마찬가지로 접합 상피는 염증 세포에서 박테리아, 이물질 및 삼출물의 통과를 촉진한다 9.

쥐의 PD 유도에 대해 가장 많이 보고된 실험 모델 중 하나는 치아 주위에 합자를 배치하는 것인데, 이는 기술적으로 어렵지만 신뢰할 수 있습니다10. 합자 배치는 치태와 박테리아 축적을 촉진하여 치주 조직 염증 및 파괴를 유발하는 치은 고랑에 dysbiosis를 생성합니다11. 치주 부착의 상실 및 치조골의 재흡수는 이 쥐 모델8에서 7일 이내에 발생할 수 있다.

PD에 대한 또 다른 동물 모델은 치은 조직에 LPS를 주입하는 것으로 구성됩니다. 결과적으로 파골 세포 형성과 뼈 손실이 자극됩니다. 이 모델의 조직병리학적 특징은 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인, 콜라겐 분해 및 치조골 흡수를 특징으로 하는 인간이 확립한 PD와 유사합니다 6,8.

따라서 본 연구의 목적은 제1 상악 어금니(M1) 주위의 합자 배치와 결합된 P. gingivalis-LPS(Pg-LPS) 주사 기술을 기반으로 한 실험 PD의 간단한 쥐 모델을 설명하는 것이었습니다. 이것은 인간 PD 질환에서 관찰되는 것과 유사한 특성을 가진 모델로, 질병 진행 메커니즘 및 향후 가능한 치료법 연구에 사용될 수 있습니다.

Protocol

참고: 연구의 실험 프로토콜은 발레아레스 제도 보건 연구소의 동물 실험 윤리 위원회(CEEA-UIB, 참조 번호 163/03/21)의 승인을 받았습니다. 1. 동물 마취 및 시술 준비 수술 전 모든 수술 기구(알루미늄 입 개그, 치과 탐험가, 다이아몬드 랜스, 수술용 가위, 미세 수술용 펜치, 마이크로 바늘 홀더, 홀렌백 조각기, 골막 미세 수술 엘리베이터, 미세 수술 가위)(135°…

Representative Results

실험 단계의 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2A 는 실험 시간 0에서 M1의 고랑 주위에 합자가 배치된 외과적 개입 후 하악의 이미지를 보여줍니다. 그림 2B 는 시술 14일 후 M1 주변의 합자가 치은 고랑으로 들어가 치은의 염증을 유발하고 침윤성 축적을 일으키는 방법을 보여줍니다. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-togethe…

Discussion

이 방법은 Pg-LPS 주사와 M1 주위에 합자 배치를 결합한 기술에 따라 쥐에서 PD의 유도를 설명하며, 이 방법 후 14일 이내에 치주 조직과 치조골의 상당한 변화가 유도될 수 있음을 보여줍니다.

이 절차 중에 다른 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 동물 마취 및 시술 준비 중에 동물의 올바른 위치를 보장하고, 앞니 주위에 알루미늄 입 개그로 열린 쥐 입을 안정화하고…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (개념 증명 전화 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, ESF 유럽 사회 기금 및 ERDF 유럽 지역 개발 기금 (M.M.B; FI18/00104) 및 Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear(M.M.F.C; FPI/040/2020)을 참조하십시오. 저자는 IdISBa의 실험적 수술 및 플랫폼에서 도움을 준 Anna Tomás 박사와 Maria Tortosa에게 감사드립니다. 마지막으로 CBCT 스캐너에 액세스할 수 있는 ADEMA School of Dentistry에 감사드립니다.

Materials

Adsorbent paper point nº30  Proclinc 8187
Aprotinin Sigma-Aldrich A1153
Atipamezole Dechra 573751.5 Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)  Laboratorio Arago Sl 613112
Buprenorphine  Richter pharma 578816.6 Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner  MyRay hyperion X9 Model Hyperion X9
CTAn software SkyScan Version 1.13.4.0
Dental explorer  Proclinc 99743
Diamond lance-shaped bur  Dentaltix IT21517
Food maintenance diet Sodispain research ROD14 
Heated surgical platform PetSavers
Hollenback carver Hu-FRIEDY  HF45234
Hypodermic needle   BD  300600 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM
Isoflurane  Karizoo Isoflutek 1000mg/g
Ketamine   Dechra 581140.6 Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis  InvivoGen TLRL-PGLPS
Methanol Fisher Scientific M/4000/PB08
Micro needle holter Fehling Surgical Instruments KOT-6
Microsurgical pliers KLS Martin 12-384-06-07
microsurgical scissors  S&T microsurgical instruments SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet Mindray 
Multiplex bead immunoassay Procartaplex, Thermo fisher Scientific PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich 8187151000
Periosteal microsurgical elevator  Dentaltix CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)  Roche 10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS) Capricorn Scientific PBS-1A
PhosSTOP  Roche 4906845001 Commercial phosphatase inhibitor tablet 
Plastic vial SPL Lifesciencies 60015 1.5mL
Saline Cinfa 204024.3
Stereo Microscope  Zeiss Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light Zeiss
Surgical scissors  Zepf Surgical 08-1701-17
Syringe  BD plastipak 303172 1mL
Veterinary dental micromotor Eickemeyer 174028
Xylazine Calier 20102-003 Xilagesic 20 mg/mL

References

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Citer Cet Article
Munar-Bestard, M., Villa, O., Ferrà-Cañellas, M. d. M., Ramis, J. M., Monjo, M. Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model. J. Vis. Exp. (192), e64842, doi:10.3791/64842 (2023).

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