Summary

Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Abstract

O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.

Introduction

O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidadeao longo da vida 1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)3. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT) e encefalopatia traumática crônica (ETC)4,5,6. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração induzida por TCE permanecem obscuros e, portanto, representam uma área ativa de estudo. Para obter informações sobre como os neurônios respondem e se recuperam do TCE, um método para monitorar proteínas fluorescentemente marcadas de interesse, especificamente dentro dos neurônios, por imagens intravitais longitudinais em camundongos após TCE é descrito aqui.

Para tanto, este estudo mostra como combinar um procedimento cirúrgico para a administração de TCE de crânio fechado semelhante ao relatado anteriormente7,8, juntamente com um procedimento cirúrgico para implante de janela craniana para imagem intravital a jusante, como descrito por Goldey e cols.9. Notadamente, é inviável implantar uma janela craniana primeiro e, posteriormente, realizar um TCE na mesma região, pois o impacto da queda de peso que induz o TCE é suscetível de danificar a janela e causar danos irreparáveis ao camundongo. Portanto, esse protocolo foi desenhado para administrar o TCE e, em seguida, implantar a janela craniana diretamente sobre o local do impacto, tudo dentro da mesma sessão cirúrgica. Uma vantagem de combinar o TCE e o implante de janela craniana em uma única sessão cirúrgica é a redução do número de vezes que um camundongo é submetido à cirurgia. Além disso, permite monitorar a resposta imediata (ou seja, na escala de tempo de horas) ao TCE, em vez de implantar a janela em uma sessão cirúrgica posterior (ou seja, imagens iniciais iniciadas em uma escala de tempo de dias pós-TCE). A janela craniana e a plataforma de imagem intravital também oferecem vantagens sobre a monitorização de proteínas neuronais por métodos convencionais, como a imunomarcação de tecidos fixos. Por exemplo, menos camundongos são necessários para imagens intravitais, já que o mesmo camundongo pode ser estudado em vários pontos de tempo, em oposição a coortes separadas de camundongos necessárias para pontos de tempo discretos. Além disso, os mesmos neurônios podem ser monitorados ao longo do tempo, permitindo rastrear eventos biológicos ou patológicos específicos dentro da mesma célula.

Como prova de conceito, a expressão neurônio-específica da proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob o promotor de sinapsina é demonstrada aqui10. Essa abordagem pode ser estendida para 1) diferentes tipos de células cerebrais utilizando outros promotores específicos de tipos celulares, como promotor de proteína básica de mielina (MBP) para oligodendrócitos e promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrócitos11 , 2) diferentes proteínas-alvo de interesse pela fusão de seus genes com o gene EGFP e 3) co-expressão de múltiplas proteínas fundidas a diferentes fluoróforos. Aqui, o EGFP é embalado e expresso através da administração de vírus adenoassociado (AAV) através de uma injeção intracraniana. Um TCE de crânio fechado é administrado usando um dispositivo de queda de peso, seguido pelo implante de uma janela craniana. A visualização do EGFP neuronal é obtida através da janela craniana, usando microscopia de dois fótons para detectar a fluorescência do EGFP in vivo. Com o laser de dois fótons, é possível penetrar mais profundamente no tecido cortical com o mínimo de fotodano, permitindo repetidas imagens longitudinais das mesmas regiões corticais dentro de um camundongo individual por dias e até meses12,13,14,15. Em suma, essa abordagem de combinação de cirurgia de TCE com imagem intravital visa avançar no entendimento dos eventos moleculares que contribuem para a patologia da doença induzida por TCE16,17.

Protocol

Todos os protocolos relacionados aos animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo Comitê do National Research Council (US). Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (Permit Number 202100057). Resumidamente, como mostra o esquema do estudo (Figura 1), o animal recebe uma injeção viral, um TCE, um implante de janela e, em seguida,…

Representative Results

Como prova de conceito para este protocolo, partículas virais expressando AAV-Syn1-EGFP foram injetadas no córtex cerebral de camundongos machos TDP-43 Q331K/Q331K (fundo C57BL/6J)19 com a idade de 3 meses. Nota-se que animais selvagens C57BL/6J também podem ser usados, no entanto, este estudo foi realizado em camundongos TDP-43 Q331K/Q331K porque o laboratório é focado na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Uma cirurgia de TCE foi realizada 4 semanas após a injeç…

Discussion

Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estrei…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Miguel Sena-Esteves, da University of Massachusetts Chan Medical School, por presentear o vírus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e a Debra Cameron, da University of Massachusetts Chan Medical School, por desenhar o esboço do crânio de camundongos. Agradecemos também aos membros atuais e passados dos laboratórios Bosco, Schafer e Henninger por suas sugestões e apoio. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS e NH.

Materials

Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379
BD insulin syringe BD NDC/HRI#08290-3284-38 5/16" x 31G
Betadine Purdue NDC67618-151-17 including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Cefazolin HIKMA Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish Parkell SKU: S387 For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators ZORO catlog #: G9531702
Catalyst Parkell S371 full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder Parkell S396 Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill Foredom H.MH-130
Dental drill controller Foredom HP4-310
Dexamethasone Phoenix NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit Microcopy Lot# C150113 Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal Fisher Scientific 04355223EA 75%
FG1/4 carbide bit Microcopy Lot# C150413 Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit Microcopy Lot# C150309 Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost N/A N/A Custom-manufactured
Heating apparatus CWE TC-1000 Mouse equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket CVS pharmacy E12107 extra heating device and be used after surgery
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber Vetequip 89012-688 induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine Vetequip 911103
Isoflurane volatilizing machine holder Vetequip 901801
Leica surgical microscope Leica LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment Picetal NDC 46066-753-55
Marker pen Delasco SMP-BK
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller World Precision Instruments micro4 and UMP3
Microliter syringe Hamilton Hamilton 80014 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps CAROLINA Item #:625314 Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent McKesson Corporation N/A Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1 Nikon SMZ745 Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2 Zeiss LSM 7 MP two-photon microscope
Multiphoton laser Coherent Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture Harvard Apparatus catlog# 59-6860 6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
No-Snag Needle Holder CAROLINA Item #: 567912
Quick base liquid Parkell S398 "B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1 Eurostat eurostat es5-300
Regular scissor 2 World Precision Instruments No. 501759-G
Round cover glass 1 Warner instruments CS-5R Cat# 64-0700 for 5 mm of diameter
Round cover glass 2 Warner instruments CS-3R Cat# 64-0720 for 3 mm of diameter
Rubber rings Orings-Online Item # OO-014-70-50 O-Rings
Saline Bioworld L19102411PR
Spring scissor 1 World Precision Instruments No. 91500-09 tip straight
Spring scissor 2 World Precision Instruments No. 91501-09 tip curved
Stereotaxic platform KOPF Model 900LS
Super glue Henkel Item #: 1647358
surgical Caliper World Precision Instruments No. 501200
Surgical forceps 1 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical forceps 2 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 0103-5-PO style 5, straight
Surgical forceps 3 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 72912
Surgical forceps 4 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical gauze ZORO catlog #: G0593801
Surgical lamp Leica Leica KL300 LED
UV box Spectrolinker XL-1000 also called UV crosslinker
Vaporguard Vetequip 931401
Vetbond Tissue Adhesive 3M Animal Care Part Number:014006

References

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Médecine. 99 (32), 21601 (2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

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Citer Cet Article
Zhong, J., Gunner, G., Henninger, N., Schafer, D. P., Bosco, D. A. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (194), e64701, doi:10.3791/64701 (2023).

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